家蚕bmo-miR-7靶基因Bmhairy的鉴定

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近年来,家蚕的microRNA越来越成为研究的热点,许多研究小组综合运用基因芯片、Northern杂交和Solexa测序等方法,鉴定了家蚕保守的和独特microRNA,分析了它们在家蚕不同发育过程的表达模式,为进一步阐明microRNA在家蚕发育中的功能研究奠定了基础。   在果蝇感觉器官发育的过程中,miR-7的异位表达能造成翅缘缺刻、刚毛密度增加等突变,表明miR-7在调控昆虫的感觉器官发育过程中扮演了重要角色。果蝇Hairy基因在周围神经系统的发育过程中能够抑制促神经基因的表达、限定刚毛的分布模式和定位感觉器官的发育。Hairy突变造成刚毛异位和刚毛密度增加。已有研究表明,果蝇的hairy是miR-7的靶基因,miR-7和hairy3UTR结合位点高度保守。在家蚕中的hairy和miR-7是否也存在调控关系,可能的调控模式又是什么?本文对此进行了初步探索。   1.家蚕Bmhairy基因的克隆及序列分析   基于氨基酸序列同源性分析,在家蚕中克隆了果蝇hairy的同源体,命名为Bmhairy,已克隆的序列长1020bp,3UTR为366bp,有2个内含子和3个外显子,编码217个氨基酸。Bmhairy有HLH、Orange和WRPW三个结构域,在脊椎动物和无脊椎动物都存在。Bmhairy与鞘翅目昆虫赤拟谷盗(Tnbolium castaneum)的hairy同源体很相似。RT-PCR和芯片实验结果表明,Bmhairy在胚胎期6h至7d持续高量表达,在五龄三天的各个纽织中有少量表达。   2.靶位点预测和双荧光素酶报告基因测定   利用RNAhybrid在线预测,发现在Bmhairy基因的3UTR有一个bmo-miR-7的潜在靶位点。将bmo-miR-7 mimics和带有Bmhairy3UTR的荧光素酶报告基因在家蚕胚细胞系(BmE)中共转染,结果表明,bmo-miR-7与Bmhairy之间存在调控关系。   3.家蚕Bmhairy基因的原核表达和多克隆抗体制备   预测Bmhairy基因的编码区序列,并将其亚克隆到PET-28a(+)表达载体,构建成重组表达质粒;随后,将该重组质粒转化到Rosetta菌株;经IPTG诱导,Rosetta菌株以包涵体形式表达了Bmhairy蛋白;通过亲和层析和电洗脱的方法纯化该蛋白,并制备高效价的Bmhairy多克隆抗体。Western blotting杂交结果表明,抗原和抗体之间有很好的特异性。在24h、3d、6d的胚胎中,尽管bmo-miR-7的的表达量上升很快,但是Bmhairy的蛋白量并没有显著下调,在1d、4d和8d的蛹中,bmo-miR-7波动表达,但是Bmhairy蛋白量无明显变化。所以我们推测:Bmhairy可能只是bmo-miR-7的中性或精细调控靶基因,而不是开关靶基因。
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