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里氏木霉（Trichoderma reesei，teleomorph: Hypocrea jecorina）是一种嗜温的丝状真菌，由于其高产纤维素酶的能力，在工业上被广泛应用。同时由于该菌具有很强的蛋白分泌能力和对人的安全性，已经被开发成表达同源蛋白和异源蛋白的良好真菌宿主。自里氏木霉被发现至今已经对其开展了半个多世纪的研究，并取得了大量研究成果，特别是2008年Qm6a菌株基因组测序工作的完成和之后Rut-C30基因组的公布，有助于更好地了解其高效分解纤维素和分泌蛋白的机理，为进一步遗传改造获取更高效的生产菌株提供了良好的平台。 里氏木霉中XYR1是最主要的纤维素酶基因的激活转录因子，它的敲除突变导致里氏木霉不产纤维素酶，虽然先前实验表明XYR1控制了一些纤维素酶和半纤维素酶基因的表达，但至今为止仍然缺乏对其功能的全面认识。另一方面，里氏木霉由于本身β-葡萄糖苷酶活的低下而影响其纤维素酶系的效率，如何改进纤维素酶系是是里氏木霉改造过程中的一大问题。因此本论文的目的在于探索和阐述XYR1在里氏木霉多个生命过程中多效性调控作用并将其运用于提高纤维素酶的产生，以及通过提高其β-葡萄糖苷酶活来增强其整个纤维素酶系的效率。本论文主要包含以下三个部分: 首先，运用RNA-seq技术对里氏木霉出发株和xyr1敲除子进行了表达谱分析，结果发现在木质纤维素诱导条件下差异表达的有467个基因，广泛分布在糖代谢、脂代谢、蛋白质降解、次级代谢、小分子转运等类别;其中受XYR1上调的基因包括了几乎所有功能己知的纤维素酶基因，另外和纤维素降解相关的Swollenin、Cip1、Cip2也发现受XYR1显著上调，值得注意的是有18个MFS超家族（major facilitator superfamily）的转运蛋白基因也受到XYR1的正调控，其中11个为预测为转运单糖和寡糖的膜转运蛋白。另一方面，在葡萄糖培养条件下，有281个基因的表达受XYR1的调控，其中涉及到小分子转运、脂代谢、次级代谢、氨基酸代谢等生命活动。这说明XYR1直接调控或间接影响了多个代谢途径以及其他生命活动，它的功能足见十分重要。 其次，通过在里氏木霉中异源表达斜卧青霉来源的β-葡萄糖苷酶基因(pbgll)，显著提高了里氏木霉发酵液中的β-葡萄糖苷酶活至6到8倍，以致总纤维素酶活上升30％，同时转化子在水解经过预处理的玉米茎时糖化率也得到显著提高，另外补加实验进一步证明PBGL1可以有效地增强里氏木霉纤维素酶对纤维素底物的糖化能力。在里氏木霉pbgl1转化子的基础上导入xyr1基因，使得总纤维素酶活进一步提高20％。因此过表达正调控转录因子也可以有效提高纤维素酶的产量，为今后的菌株改造提供了新的手段。另外通过实验验证发现，xyr1上游8kb的DNA序列并不足以驱动xyr1基因的正常表达，这也是xyr1在xyr1敲除子中的互补必须在原位的原因。但该段的DNA是xyr1正常表达所必需，xyr1正常表达的具体机理仍然未知。 第三，在里氏木霉尿苷缺陷型菌株的基础上，利用Cre-loxP重组系统检验其对染色体大片段敲除的效率，并利用ura5作为双向筛选标记，在诱导条件下启动重组酶ere的大量表达，实现两个loxP位点间的高效重组，在里氏木霉中成功实现10 kb、50 kb等大片段染色体DNA的删除。里氏木霉50 kb大片段删除的突变子中表型发生了明显变化，生长和产孢受到严重影响。相比之前报道的丝状真菌的大片段敲除方法，Cre-loxP具有更高的重组效率以及条件诱导性，因此可以应用于里氏木霉染色体大片段操作以及新功能基因的挖掘等方面。 以上研究为深入认识里氏木霉重要转录因子的调控功能，以及改进产纤维素酶能力提供了支持，并为实现里氏木霉染色体大片段操作提供了高效的手段，有助于进一步遗传改造里氏木霉以实现生产目的。