论文部分内容阅读
农用抗生素120(简称“农抗120”)是由刺孢吸水链霉菌北京变种产生的一种具有广谱抗真菌活性的农用抗生素。它不仅对白粉病、炭疽病等多种真菌病原菌具有显著的防治功效,同时具有促进植物增产的作用,因而在植物真菌病害生物防治、促进农业生产方面发挥了重要的作用。农抗120由刺孢吸水链霉菌北京变种的多种次级代谢产物组成,然而其活性成分至今尚未明确。因此,本研究通过对刺孢吸水链霉菌北京变种中的次级代谢产物进行分离鉴定,明确了农抗120中的两种脂溶性活性成分,并试图阐明这两种活性成分的生物合成途径,进而能够在分子水平上进行相应的定向改造,提高其活性和产量,最终提高农抗120的生物防治功效及社会经济效益。
本研究通过对刺孢吸水链霉菌北京变种的次级代谢产物进行分离、纯化,利用高压液相色谱.质联用技术对其进行检测显示,一种组分是茴香霉素及其衍生物,另一种组分是四烯类化合物。两者都对农抗120生物活性指示菌具有明显的抑菌作用。通过核磁共振对分离纯化的四烯化合物进行结构鉴定证明该成分为四霉素B组分(Tetramycin B)。此外也在发酵产物中检测到了四霉素的A组分。
基于基因组扫描序列,对四霉素B组分的生物合成途径进行分析,发现了与四霉素B组分生物合成相关的基因簇。基因中断实验证明突变株YF21不产四霉素A、B两组分,由此证明该基因簇与四霉素合成相关。通过分析发现该基因簇包含四霉素合成所需要的Ⅰ型聚酮合酶和其他后修饰基因等,并对其生物合成途径进行了推测。四霉素生物合成基因簇的获得为后续的组合生物合成、农抗120生物活性提高等尝试提供了研究基础。对于另一组分茴香霉素,尝试了利用O-甲基转移酶基因的兼并引物的PCR扩增、异源表达以及基因组扫描序列信息分析等多种不同的方法挖掘其生物合成基因簇,为进一步克隆茴香霉素生物合成基因建立了基础。
DNA大分子研究是生命科学研究的热点领域,在天然DNA骨架上发现的硫修饰构成了对DNA结构的又一新补充。因此,进一步研究DNA分子骨架硫修饰的生物化学基础,探索DNA分子硫修饰在基因表达和DNA修复、限制和修饰方面的作用,揭示DNA磷硫酰化修饰的生物学功能具有重要意义。本研究主要以细菌荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescence Pf0-1和沙门氏菌Salmonella enterica serovar Cerro87为材料开展了以上两方面的研究。
源于变铅青链霉菌的DNA磷硫酰化修饰现象广泛存在于细菌中,在荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescence Pr0-1中也含有与dnd同源的基因簇。本工作证明了在荧光假单胞菌中证明SpfD蛋白参与该菌株的Dnd表型,并且体外实验证实该蛋白具有ATPase酶活性。由此推测DndD同源蛋白有可能在DNA骨架上磷硫酰化修饰参与能量供给的作用,从而初步解析了SpfD蛋白在DNA分子骨架硫修饰生物化学途径中的作用,为进一步体外重建DNA磷硫酰化修饰的生化过程提供了相应的参考。
在沙门氏菌Salmonella enterica Cerro87中,dpt基因簇赋予宿主Dnd表型和磷硫酰化依赖的限制修饰作用。本研究在此基础上观察到缺失DNA磷硫酰化修饰基因dptBCDE的突变株XTG102在生理形态表型上与野生型有明显的差异。研究发现缺失整个DNA磷硫酰化修饰基因的突变株不仅生长滞缓,而且在菌落和细胞形态方面变化明显。通过对dpt的单基因同框缺失表明,dptC和dptE的突变株YF11和YF13对生长有滞缓作用,但菌落和细胞形态方面差异不明显。由此推测,dpt基因簇中负责磷硫酰化修饰的dptBCDE四个基因和负责潜在限制功能的dptFGH三个基因分别形成复合体,它们相互作用从而实行宿主的限制修饰功能并保持菌体的正常生长。该现象的发现对后续研究DNA磷硫酰化修饰所具有的生物学意义具有重要参考价值。