论文部分内容阅读
多巴胺(dopamine，DA)是哺乳动物中枢神经系统主要的儿茶酚胺类神经递质，因此成为近五十年研究的焦点之一。已有研究表明，作为中枢神经系统重要递质的DA密切牵涉到正常躯体的运动、感觉认知、学习记忆和内脏活动等调节机能，以及帕金森病、亨廷顿病、药物成瘾、精神分裂症等病理过程。
DA的神经生物学效应通过其受体的作用而实现。研究证实DA受体可分为D1-D5，其中D1和D5在分子结构和机能上较为接近，因此归为D1受体，而D2-D4通称为D2受体。以往的研究证实在哺乳动物位于中脑黑质的DA神经元主要投射到纹状体，所释放的DA通过D1和D2受体调节纹状体神经元的活动。DA及其受体与脊髓之间的联系一直是神经科学者欲证实的问题之一，虽然已有众多作者借助组化、免疫组化、原位杂交、放射自显影以及电镜等技术方法对其进行了观察，但对这些受体阳性神经元形态学方面的认识目前还远远不够。为此，本实验设计借助免疫组织化学单标记和荧光免疫组化双标记以及免疫印迹技术方法对正常大鼠脊髓不同部位和区域的DA受体阳性神经元进行了系列观察：包括D1、D2两种受体阳性神经元数量、大小、突起数量和长度，以及比较脊髓不同部位和区域的阳性神经元的形态学特征。同时，本研究也设计借助6-羟基多巴(6-hydroxy-dopamine，6-OHDA)损毁实验的动物模型，从形态学观察证实脊髓不同部位和区域的D1、D2受体阳性神经元的形态、数量和分布形式的变化，以及D1、D2抗原表达的变化，为深入探讨和彻底证实DA及其受体阳性神经元的形态特征、生理机能和在脊髓损伤病理机制中的作用提供形态学资料。
方法：
1.免疫组织化学方法通过免疫组化方法观察正常SD大鼠不同部位不同区域脊髓灰质D1、D2受体阳性神经元的形态、数量和分布特征，以及黑质-纹状体去DA能神经支配后脊髓灰质D1、D2受体阳性神经元的变化。运用免疫荧光双标记技术探察D1与CHAT抗原两者相互共存的情况。
2.Western-blot(免疫印迹)方法应用Western-blot观察证实正常脊髓灰质不同部位和不同区域D1、D2蛋白表达量的差异以及损伤诱导其变化的规律。3.动物模型的构建和评价借助大鼠脑定位仪，在SNc与MFB分别注射3μl6-OHDA(浓度为3μg/μl)制作损伤模型。模型动物的检测和评价包括：①行为学(握力测试，APO诱导旋转实验)测试。②组织病理学染色(黑质区域的HE和Nissel组化染色，黑质和纹状体区域的TH免疫组化染色)。
结果：
1.大鼠脊髓DA受体阳性神经元形态及其分布特征1.1脊髓灰质D1、D2受体阳性神经元各自的形态特征和分布规律本实验对正常SD大鼠脊髓DA受体阳性神经元进行免疫组化特异性标记，光镜观察显示：D1受体阳性细胞形状为不规则多边形，细胞中央淡染，光镜高倍镜下阳性产物为颗粒状定位于细胞膜和胞浆内。可见阳性神经元具有少量突起，分支较少，形态学显示具备树突的特征。D1受体阳性神经元主要分布脊髓灰质前角，中间带和后角少见D1受体阳性神经元。阳性神经元在颈、胸、腰骶脊髓三个不同部位的分布密度没有明显的优势性。
D2受体阳性神经元胞体也呈现不规则多边形，阳性神经元中间淡染，阳性产物为颗粒状定位于细胞膜和胞浆内。光镜观察显示阳性神经元大小不一，而且在脊髓前角明显可见大体积的神经元成群聚集于前外侧部，中等大小的位于内侧，在脊髓中间带和后角的为中等大小和小细胞。无论阳性神经元胞体大小，其突起均不明显。在脊髓三个区域和部位的分布D2受体阳性神经元，免疫组化资料未见明显差异。
1.2脊髓不同区域和部位D1、D2受体阳性神经元相互之间形态和分布的比较脊髓灰质不同区域D1、D2阳性神经元比较结果显示，在脊髓前角、中间带和后角三个不同区域两类阳性神经元的数量明显不同：即D2受体阳性神经元明显多于D1受体阳性神经元。但是脊髓前角D1受体阳性神经元的直径明显大于D2受体阳性神经元。在颈脊髓、胸脊髓和腰骶脊髓三个部位的统计结果显示，D2受体阳性神经元的数量均明显更多D1受体阳性神经元，前角D1受体阳性神经元平均直径均大于D2受体阳性神经元。
2.脊髓D1和ChAT阳性神经元相关蛋白共存关系的实验证实在颈、胸、腰骶脊髓前角的光镜观察显示，D1受体阳性神经元形状不规则，体积较大，明显具有ChAT(胆碱乙酰转移酶)阳性神经元的形态学特征，本实验为此借助D1和ChAT免疫荧光双标记，光镜观察结果显示，在颈、胸、腰骶脊髓前角的D1与ChAT之间的确存在相互共存。
3.脊髓不同部位D1、D2受体蛋白表达的实验探测借助Western-blot方法对大鼠脊髓不同区域和部位D1、D2受体蛋白表达的探测和比较结果显示，脊髓灰质前角D1受体蛋白的表达明显高于后角。而在颈、胸、腰骶脊髓三个不同部位之间D1受体蛋白的表达差异不明显。在脊髓灰质不同区域，而D2受体蛋白在后角的表达则明显高于前角，而且在颈、胸、腰骶脊髓三个不同部位D2受体蛋白的表达存在统计学差异：即在腰骶脊髓的表达明显高于其它部位。脊髓三个不同部位的前角均有D1、D2受体蛋白的表达，但其表达增加量不同，比较结果显示D2受体蛋白的表达增加量明显高于D1。
4.6-OHDA损伤诱导大鼠行为学和组织病理学变化的实验观察4.1实验动物的行为学检测借助握力实验检测模型动物的肌张力和运动协调机能。结果显示，实验动物手术后与手术前相比悬挂时间明显延长。腹腔注射阿朴吗啡实验能够诱导出动物的旋转运动。
4.26-OHDA诱导黑质、纹状体、脊髓的组织病理学变化的形态学证实1)组织病理学检查：HE染色显示，模型动物损伤组黑质致密部较对照组神经元数量明显减少，并伴随炎细胞浸润和胶质细胞反应性增生。Nissel组化染色显示，实验动物黑质神经元明显减少，同时可见神经元内尼氏体出现消溶和分解等病理变化。
2)免疫组织化学探察：
①光镜观察显示作为DA标记物的TH阳性神经元在模型动物的中脑黑质损伤组其数量显著减少，仅有少数神经元幸存，而且突起明显变短和减少。纹状体内多巴胺能纤维主要来自于中脑SNc的投射，因此损伤导致纹状体TH阳性纤维也明显减少。脊髓灰质不同区域的TH阳性纤维也显著的减少，但脊髓不同部位TH阳性纤维的减少量差异不明显。
②实验动物损伤组脊髓灰质D1、D2受体阳性神经元形态结构没有明显的变化。相比于对照组，损伤组脊髓灰质前角D1受体阳性神经元数量明显增多，而且在颈、胸、腰骶脊髓三个不同部位的分布密度均增加，尤其以腰骶脊髓增加的量最明显。与对照组相比，脊髓灰质不同区域损伤组D2受体阳性神经元数量显著增多，三个不同部位的分布密度也明显增加，以腰骶脊髓增加的量更显著。损伤后两类阳性神经元计数比较，脊髓不同部位不同区域D2受体阳性神经元的增加量均更加明显。
5.6-OHDA损伤诱导脊髓不同部位D1、D2受体蛋白表达变化的实验探测相比于对照组，实验动物的颈、胸、腰骶脊髓灰质三个不同部位D1受体蛋白呈现高表达，尤其以腰骶脊髓增加的量明显。同样，损伤组D2受体蛋白的表达在颈、胸、腰骶脊髓三个不同部位均较对照组高，而且以腰骶脊髓的增加最显著。6-OHDA损伤诱导脊髓三个不同部位的D1和D2受体蛋白表达的比较结果显示，D2受体蛋白的表达明显高于D1受体蛋白。
结论：
1.D1受体阳性神经元主要存在于脊髓灰质前角，它们在脊髓三个部位的分布没有明显差异。在脊髓灰质前角，D1受体阳性神经元与ChAT相互之间存在共存，提示D1受体阳性神经元可能牵涉到脊髓前角运动机能的调节。D2受体阳性神经元呈现明显的大、中、小三种类型，而且分别具有特定区域性分布，在脊髓灰质前角、中间带和后角不同区域D2受体阳性神经元的广泛分布和大量聚集，可能提示该类神经元与脊髓感觉、运动、内脏活动的调控有关。
2.D1受体蛋白在颈、胸、腰骶脊髓前角区域特征的高表达，提示该受体蛋白可能牵涉到脊髓的运动调节机能。而D2受体蛋白在脊髓灰质前角和后角的高表达以及在腰骶脊髓特征性的高表达，提示其对脊髓不同机能活动具有广泛的调节作用。脊髓不同区域和部位D2受体蛋白的优势性表达和阳性神经元的广泛分布，表明其对脊髓功能的调节作用比D1更为重要。
3.6-OHDA损伤诱导黑质-纹状体去DA能神经支配，导致模型动物肌张力增加，黑质、纹状体和脊髓灰质多巴胺神经元和突起减少，结果证实6-OHDA特异性毒性作用、损伤模型的制作成功、黑质-脊髓DA神经通路的存在。黑质-纹状体去DA能神经支配诱导脊髓灰质D1、D2受体阳性神经元的数量增加以及D1、D2受体蛋白的高表达，结果一方面提示黑质-脊髓DA神经通路对脊髓灰质特种类型神经元的调节作用，另一方面表明DA受体蛋白和阳性神经元对黑质-脊髓DA通路去神经支配的突触后反应的敏感特异性。