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以华南农业大学野生稻核心收集圃的野生稻为材料,采用平板划线法和显微镜检测分离纯化其内生菌,经固氮酶活性检测,固氮酶nifH基因扩增,全细胞蛋白电泳及系统发育分析,获得了三个较大类群和45个代表菌株。测定了其生理生化特性并对类群Ⅲ的代表菌株进行了进一步的鉴定,结果如下:
内生固氮菌的筛选及聚类:以陵水普通野生稻、海南琼洲普通野生稻、高州普通野生稻、江西东乡普通野生稻、广西药用野生稻、宽叶野生稻、瘤粒野生稻、大护颖野生稻和澳洲野生稻的根、茎、叶为材料,利用不同碳源的选择性培养基共分离到142株内生菌,乙炔还原法测得70株有固氮酶活性。用固氮酶nifH基因PCR扩增,得到约360bp的片段。SDS-PAGE对供试菌株进行了聚类,在82%以上的水平上将其聚为45个不同类群。对部分菌株进行了16SrDNA序列测定,结果表明这些内生固氮菌分布于α亚纲,γ亚纲Klebsiella,Xanthomonas,Pantoea,Pseudomonas,Azosprillum,Moraxellao,Stenotrophomonas,Burkholderia,Azorhizobium,Citrobacter和黄杆菌刚的Chryseobacterium等12个属,具有较大的遗传多样性,与全细胞蛋白电泳聚类结果呈现的多样性一致。
内生固氮菌的固氮特性研究:使用NFb半固体培养基,利用气相色谱仪测定各代表菌株在不同温度、pH值、盐浓度、铵离子浓度下的固氮情况,结果得到多株能在pH5.0~10.0,1%~3%的NaCl浓度,在18~45℃的温度下,能够生长和固氮的菌株。对代表菌株的溶磷性进行了定性检测和定量测定,测得42株溶磷菌,它们的溶磷量分布在1.31±0.13~28.59±0.49μg·ml-1;同时把菌株接种到籼型水稻品种华航1号,结果这些菌株均具有不同程度的促进生长效果。
类群Ⅲ菌株的分子鉴定:以Pantoeaagglomerans中的模式菌株ATCC27155作为参比菌株,对类群Ⅲ中菌株Ls8进行分子水平上的鉴定。结果发现:模式菌株ATCC27155没有乙炔还原活性,不能检测到mfH片段,二者的蛋白质图谱、IS-PCR指纹图谱和脂肪酸组成成份图谱均存在明显差异,经Biolog板鉴定菌株ATCC27155与Ls8在利用碳源上有显著区别,DNA-DNA杂交确定其同源性为54.1%。与Citrobacterfarmeri和Salmonellaenterica模式菌株的16SrRNA序列相似性分别为97.7%和97.3%,故将Ls8代表的类群Ⅲ菌株暂定为Citrobacter属的一个新种。