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目的：
妊娠滋养细胞疾病（Gestational trophoblastic disease，GTD）是一种罕见的由滋养细胞分化不良引起的妊娠并发症。其中包括葡萄胎（Hydatidiform mole，HM）、上皮样滋养细胞肿瘤（Epithelioid trophoblastic tumors，ETT）、胎盘部位滋养细胞肿瘤（Placental site trophoblastic tumors，PSTT）、绒毛癌（Choriocarcinoma，CCA）。HM是由妊娠后胎盘绒毛滋养细胞异常增生引起的疾病，占GTD的80%左右，有恶性转化的可能，具体机制仍不清楚。
microRNAs（miRNAs）是通过与其靶基因mRNA的3’UTR区结合导致mRNA的降解或翻译被抑制。miR-30a-5p（miR-30a）在多数肿瘤发生中扮演着抑癌基因的作用。本实验室前期工作通过miRNA高通量测序发现miR-30a与胎盘的发育相关。本课题通过分析临床HM样本和正常胎盘组织样本中miR-30a的表达差异；以人绒毛滋养层细胞系JAR、BeWo和HTR-8为模型，探讨调控miR-30a对滋养层细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响；通过生物学软件预测和验证miR-30a相关靶基因，选取参与胚胎发育和细胞分化的糖基转移酶基因B3GNT5及滋养层细胞发育的转录因子STOX2，进一步调控JAR、BeWo、HTR-8细胞中miR-30a及其靶基因B3GNT5、STOX2的表达，介导滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化，分析相应信号通路分子ERK、AKT、P38的变化，逐步揭示miR-30a参与滋养层细胞疾病HM发生发展的分子机制，为拓展HM的研究和临床诊断提供理论依据。
方法：
（一）分析miR-30a-5p在葡萄胎中的作用
1.收集临床HM组织样本和正常胎盘组织样本，RT-qPCR检测HM与正常胎盘中miR-30a的表达差异；
2.利用滋养层细胞系，以miR-30a mimics/inhibitor调控JAR、BeWo、HTR-8细胞miR-30a的表达，细胞增殖实验、Transwell实验检测对增殖、迁移、侵袭能力的影响；
3.调控滋养层细胞JAR、BeWo、HTR-8中miR-30a的表达，Western blot实验检测BAX、BCL-2、cyclin D1蛋白表达的影响；
（二）miR-30a-5p靶向B3GNT5调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.RT-qPCR、Western blot、IHC-P检测临床HM组织与正常胎盘组织中B3GNT5的表达水平；
2.利用滋养层细胞系，以B3GNT5siRNA/B3GNT5cDNA调控JAR、BeWo细胞中B3GNT5的表达，CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响；
3.生物学软件预测miR-30a与B3GNT5的结合位点，构建野生型和突变型载体，利用双荧光素酶报告基因实验确定miR-30a与B3GNT5之间的靶向关系；
4.以Rescue实验分析共转染miR-30a mimics/B3GNT5cDNA以及miR-30a inhibitor/B3GNT5siRNA双重调控JAR、BeWo细胞B3GNT5表达，CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测滋养层细胞JAR、BeWo的增殖、迁移、侵袭能力变化；Western blot检测调控B3GNT5对EGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT等信号通路分子蛋白的表达水平变化；
（三）miR-30a-5p靶向STOX2通过ERK、AKT、P38信号通路调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.利用临床HM组织样本和正常胎盘组织样本，采用IHC-P检测人HM与正常胎盘组织中STOX2的表达差异；
2.利用滋养层细胞系，以STOX2siRNA/STOX2cDNA调控JAR、HTR-8细胞STOX2表达，增殖实验、Transwell实验检测调控STOX2对细胞的生长、迁移、侵袭能力的影响；
3.利用生物学软件预测miR-30a与STOX2结合位点，分别构建野生型和突变型载体，利用双荧光素酶报告基因实验确定miR-30a与STOX2之间的靶向关系；
4.以Rescue实验分析共转染miR-30a mimics/STOX2cDNA以及miR-30ainhibitor/STOX2siRNA双重调控JAR、HTR-8细胞STOX2表达，CCK-8、克隆形成、EdU实验、Transwell实验检测滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力；Western blot检测调控STOX2对ERK/p-ERK、AKT/p-AKT、P38/p-P38信号通路分子蛋白的表达水平变化；
5.共同转染STOX2和B3GNT5的干扰或过表达，CCK-8和EdU实验检测JAR细胞的增殖能力；Western blot实验检测JAR细胞中BAX、PCNA蛋白水平的变化。
结果：
（一）分析miR-30a-5p在葡萄胎中的作用
1.miR-30a在人滋养细胞疾病HM组织和正常胎盘组织中存在差异性表达，且在HM组织中呈现低表达；
2.下调miR-30a可促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力，反之则抑制；
3.下调miR-30a可促进滋养层细胞BCL-2、cyclin D1蛋白的表达，抑制BAX表达；上调miR-30a可抑制BCL-2、cyclin D1蛋白的表达，促进BAX表达；
（二）miR-30a-5p靶向B3GNT5调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.B3GNT5在人HM组织和正常胎盘组织中存在差异性表达，且在HM组织中呈现高表达；
2.上调B3GNT5的表达可促进滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力，下调B3GNT5可抑制滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力；
3.生物学软件预测结合双荧光素酶报告基因实验证实miR-30a与B3GNT5存在直接的靶向关系；
4.与单独转染miR-30a mimics组相比，共同转染miR-30a mimics和B3GNT5cDNA组滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力有所回调，且影响滋养层细胞ERK、AKT信号通路相关蛋白的表达；共同转染下调组则出现相反的结果；
5.上调B3GNT5可以营救miR-30a mimics对滋养层细胞EGFR的抑制作用；下调则相反的结果。
（三）miR-30a-5p靶向STOX2通过ERK、AKT、P38信号通路调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.与正常胎盘组织相比，STOX2在人HM中是高表达；
2.上调STOX2可促进滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力，下调STOX2则抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力；
3.miR-30a与STOX2存在新的靶向关系；
4.与单独转染miR-30a mimics组相比，共同转染miR-30a mimics和STOX2cDNA组滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力有所回调，且影响ERK、AKT、P38信号通路相关蛋白的表达；共同转染下调组则出现相反的结果；
5.上调/下调STOX2对B3GNT5的表达变化没有影响，上调/下调B3GNT5对STOX2的表达变化亦没有影响；
6.共同转染STOX2和B3GNT5的过表达，可促进滋养层细胞的增殖能力；共同转染STOX2和B3GNT5的干扰，可抑制滋养层细胞的增殖能力；
结论：
（一）miR-30a在HM中低表达，并可促进滋养层细胞JAR、BeWo、HTR-8细胞的增殖、迁移、侵袭能力。
（二）miR-30a-5p通过靶向B3GNT5，介导ERK、AKT信号通路，调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。
（三）miR-30a-5p亦可靶向转录因子STOX2，通过ERK、AKT、P38信号通路，调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。
妊娠滋养细胞疾病（Gestational trophoblastic disease，GTD）是一种罕见的由滋养细胞分化不良引起的妊娠并发症。其中包括葡萄胎（Hydatidiform mole，HM）、上皮样滋养细胞肿瘤（Epithelioid trophoblastic tumors，ETT）、胎盘部位滋养细胞肿瘤（Placental site trophoblastic tumors，PSTT）、绒毛癌（Choriocarcinoma，CCA）。HM是由妊娠后胎盘绒毛滋养细胞异常增生引起的疾病，占GTD的80%左右，有恶性转化的可能，具体机制仍不清楚。
microRNAs（miRNAs）是通过与其靶基因mRNA的3’UTR区结合导致mRNA的降解或翻译被抑制。miR-30a-5p（miR-30a）在多数肿瘤发生中扮演着抑癌基因的作用。本实验室前期工作通过miRNA高通量测序发现miR-30a与胎盘的发育相关。本课题通过分析临床HM样本和正常胎盘组织样本中miR-30a的表达差异；以人绒毛滋养层细胞系JAR、BeWo和HTR-8为模型，探讨调控miR-30a对滋养层细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响；通过生物学软件预测和验证miR-30a相关靶基因，选取参与胚胎发育和细胞分化的糖基转移酶基因B3GNT5及滋养层细胞发育的转录因子STOX2，进一步调控JAR、BeWo、HTR-8细胞中miR-30a及其靶基因B3GNT5、STOX2的表达，介导滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化，分析相应信号通路分子ERK、AKT、P38的变化，逐步揭示miR-30a参与滋养层细胞疾病HM发生发展的分子机制，为拓展HM的研究和临床诊断提供理论依据。
方法：
（一）分析miR-30a-5p在葡萄胎中的作用
1.收集临床HM组织样本和正常胎盘组织样本，RT-qPCR检测HM与正常胎盘中miR-30a的表达差异；
2.利用滋养层细胞系，以miR-30a mimics/inhibitor调控JAR、BeWo、HTR-8细胞miR-30a的表达，细胞增殖实验、Transwell实验检测对增殖、迁移、侵袭能力的影响；
3.调控滋养层细胞JAR、BeWo、HTR-8中miR-30a的表达，Western blot实验检测BAX、BCL-2、cyclin D1蛋白表达的影响；
（二）miR-30a-5p靶向B3GNT5调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.RT-qPCR、Western blot、IHC-P检测临床HM组织与正常胎盘组织中B3GNT5的表达水平；
2.利用滋养层细胞系，以B3GNT5siRNA/B3GNT5cDNA调控JAR、BeWo细胞中B3GNT5的表达，CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响；
3.生物学软件预测miR-30a与B3GNT5的结合位点，构建野生型和突变型载体，利用双荧光素酶报告基因实验确定miR-30a与B3GNT5之间的靶向关系；
4.以Rescue实验分析共转染miR-30a mimics/B3GNT5cDNA以及miR-30a inhibitor/B3GNT5siRNA双重调控JAR、BeWo细胞B3GNT5表达，CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测滋养层细胞JAR、BeWo的增殖、迁移、侵袭能力变化；Western blot检测调控B3GNT5对EGFR、ERK/p-ERK、AKT/p-AKT等信号通路分子蛋白的表达水平变化；
（三）miR-30a-5p靶向STOX2通过ERK、AKT、P38信号通路调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.利用临床HM组织样本和正常胎盘组织样本，采用IHC-P检测人HM与正常胎盘组织中STOX2的表达差异；
2.利用滋养层细胞系，以STOX2siRNA/STOX2cDNA调控JAR、HTR-8细胞STOX2表达，增殖实验、Transwell实验检测调控STOX2对细胞的生长、迁移、侵袭能力的影响；
3.利用生物学软件预测miR-30a与STOX2结合位点，分别构建野生型和突变型载体，利用双荧光素酶报告基因实验确定miR-30a与STOX2之间的靶向关系；
4.以Rescue实验分析共转染miR-30a mimics/STOX2cDNA以及miR-30ainhibitor/STOX2siRNA双重调控JAR、HTR-8细胞STOX2表达，CCK-8、克隆形成、EdU实验、Transwell实验检测滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力；Western blot检测调控STOX2对ERK/p-ERK、AKT/p-AKT、P38/p-P38信号通路分子蛋白的表达水平变化；
5.共同转染STOX2和B3GNT5的干扰或过表达，CCK-8和EdU实验检测JAR细胞的增殖能力；Western blot实验检测JAR细胞中BAX、PCNA蛋白水平的变化。
结果：
（一）分析miR-30a-5p在葡萄胎中的作用
1.miR-30a在人滋养细胞疾病HM组织和正常胎盘组织中存在差异性表达，且在HM组织中呈现低表达；
2.下调miR-30a可促进滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭能力，反之则抑制；
3.下调miR-30a可促进滋养层细胞BCL-2、cyclin D1蛋白的表达，抑制BAX表达；上调miR-30a可抑制BCL-2、cyclin D1蛋白的表达，促进BAX表达；
（二）miR-30a-5p靶向B3GNT5调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.B3GNT5在人HM组织和正常胎盘组织中存在差异性表达，且在HM组织中呈现高表达；
2.上调B3GNT5的表达可促进滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力，下调B3GNT5可抑制滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力；
3.生物学软件预测结合双荧光素酶报告基因实验证实miR-30a与B3GNT5存在直接的靶向关系；
4.与单独转染miR-30a mimics组相比，共同转染miR-30a mimics和B3GNT5cDNA组滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力有所回调，且影响滋养层细胞ERK、AKT信号通路相关蛋白的表达；共同转染下调组则出现相反的结果；
5.上调B3GNT5可以营救miR-30a mimics对滋养层细胞EGFR的抑制作用；下调则相反的结果。
（三）miR-30a-5p靶向STOX2通过ERK、AKT、P38信号通路调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的分子机制
1.与正常胎盘组织相比，STOX2在人HM中是高表达；
2.上调STOX2可促进滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力，下调STOX2则抑制细胞的增殖、迁移、侵袭能力；
3.miR-30a与STOX2存在新的靶向关系；
4.与单独转染miR-30a mimics组相比，共同转染miR-30a mimics和STOX2cDNA组滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭能力有所回调，且影响ERK、AKT、P38信号通路相关蛋白的表达；共同转染下调组则出现相反的结果；
5.上调/下调STOX2对B3GNT5的表达变化没有影响，上调/下调B3GNT5对STOX2的表达变化亦没有影响；
6.共同转染STOX2和B3GNT5的过表达，可促进滋养层细胞的增殖能力；共同转染STOX2和B3GNT5的干扰，可抑制滋养层细胞的增殖能力；
结论：
（一）miR-30a在HM中低表达，并可促进滋养层细胞JAR、BeWo、HTR-8细胞的增殖、迁移、侵袭能力。
（二）miR-30a-5p通过靶向B3GNT5，介导ERK、AKT信号通路，调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。
（三）miR-30a-5p亦可靶向转录因子STOX2，通过ERK、AKT、P38信号通路，调控滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。