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磷作为植物生长发育所必须的大量元素之一，参与了植物的光合作用、呼吸代谢、能量转化、信号传导、生物大分子合成以及酶活性的调节等，在植物的整个新陈代谢中扮演着十分重要的角色。但是，由于磷容易被土壤吸附固定而难以被植物直接吸收和利用，导致了在大多数土壤，特别是热带、亚热带地区土壤，有效磷的缺乏成为限制作物生产的主要障碍因子之一。为了提高对土壤潜在磷库的吸收和利用效率，植物形成了一系列形态、生理和分子的适应机制。其中，酸性磷酸酶被普遍认为参与了植物的磷代谢过程，对植物适应低磷胁迫发挥着重要的作用。作为特殊的酸性磷酸酶，紫色酸性磷酸酶，可能参与了植物对土壤中有机磷的利用和植株体内磷的重新分配过程。本研究为了深入了解植物紫色酸性磷酸酶的具体功能和它们与植物磷效率的关系，根据前期纯化得到的酸性磷酸酶同功酶(PvPAP3)的部分氨基酸序列，克隆了编码该蛋白的基因PvPAP3，探讨了外界磷有效性对其表达模式的调控，并且比较了其它已知的菜豆紫色酸性磷酸酶基因家族成员的表达模式与外界磷有效性的关系。为了进一步解析PvPAP3的生物学功能，本研究建立和优化了菜豆的离体毛状根转化体系，并利用该毛状根转化体系和拟南芥转化体系，研究了过量表达PvPAP3对转基因材料利用外界ATP的作用。主要结果如下：
⑴根据已纯化的PvPAP3蛋白部分氨基酸序列设计简并引物，以低磷胁迫条件下菜豆磷高效基因型G19833全长cDNA文库为模板，克隆了编码PvPAP3蛋白的候选基因PvPAP3的全长cDNA。根据PvPAP3基因的cDNA序列设计引物，获得了PvPAP3的基因组全长序列，PvPAP3的基因组全长包含了六个内含子。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白为分泌型蛋白，分子量为37 kD，切除信号肽后成熟蛋白的分子量为34 kD，这与凝胶层析技术测量纯化后的PvPAP3蛋白的分子量相符。利用PvPAP3的ORF融合GFP转化洋葱表皮细胞，确定PvPAP3属于分泌型蛋白，定位于细胞间隙。
⑵对PvPAP3的表达模式分析结果显示，PvPAP3受低磷胁迫特异诱导表达，而不受其它主要营养元素如氮、钾和铁等缺乏的调控。在低磷胁迫条件下，PvPAP3的表达模式在磷高效基因型G19833和磷低效的基因型DOR364上存在着差异。当外界磷浓度为5和50μmol．L-1时，PvPAP3在G19833的表达量显著增加。但是，只有磷水平低至5μmol．L-1才能诱导该基因在DOR364的表达。在根部，当外界磷浓度为100μmol．L-1时，PvPAP3在G19833上的表达显著高于在DOR364上的表达。
⑶对已报道的菜豆紫色酸性磷酸酶进行进化树分析，结果表明PvPAP3和PvPAP4均为低分子量紫色酸性磷酸酶，而PvPAP1和PvPAP2属于高分子量紫色酸性磷酸酶。PvPAP3和PvPAP4，PvPAP1和PvPAP2的二级结构较为相似，具有数目相近的各种二级结构。
⑷分析了菜豆紫色酸性磷酸酶基因家族中不同成员受磷有效性调控的表达模式。结果显示PvPAP1的表达不受磷的调控，表现为组成型。PvPAP2和PvPAP3拘表达受低磷胁迫的诱导，而且它们在磷高效基因型G19833上的转录水平高于磷低效基因型DOR364。PvPAP4的表达比较复杂，在叶片中为组成型表达。但是，低磷胁迫诱导了PvPAP4在磷高效基因型G19833根部的表达，在DOR364的根部未能检测到其表达。
⑸比较研究了菜豆紫色酸性磷酸酶基因家族的不同成员受干旱、盐害和过氧化等胁迫调控的表达模式。PEG模拟的干旱处理分别抑制了PvPAP1在根部和PvPAP4在叶部的表达，分别加强了PvPAP3在叶部和根部的表达以及PvPAP2在根部的表达。盐害胁迫诱导了PvPAP3在根部、PvPAP2在根部和叶部的表达，但对PvPAP1和PvPAP4的表达没有调控作用。H2O2诱导了PvPAP2在根部、PvPAP3在叶部和根部的表达，但对PvPAP1和PvPAP4的表达没有调控作用。
⑹比较研究了菜豆紫色酸性磷酸酶基因家族中不同成员受植物生长激素(ABA、乙烯利和2，4—D)调控的表达模式，结果显示ABA和乙烯利对PvPAP3的表达有明显的上调作用，乙烯利对PvPAP4的表达有微弱的抑制作用。而这些激素处理对PvPAP1和PvPAP2没有明显的调控作用。
⑺为研究PvPAP3的生物学功能，本研究建立和优化了菜豆离体毛状根的转化方法。通过子叶节侵染法，在无菌条件下成功地将双元载体转入菜豆毛状根。发现菜豆种子萌发的时间对毛状根的诱导和形成具有决定性作用。萌发35～48小时后的子叶节诱导毛状根的比率较高，且能形成较好的毛状根。
⑻在拟南芥和菜豆毛状根中对PvPAP3的功能进行了分析。结果表明当ATP作为培养介质中的磷源时，PvPAP3的过量表达显著提高了拟南芥和菜豆毛状根的生长和磷含量，缓解了低磷胁迫对生长的抑制。揭示了PvPAP3参与植物利用外源ATP中磷的生物学功能。
⑼根据PvPAP3的氨基酸序列，从菜豆中克隆了编码此蛋白的基因PvPAP3。RT-PCR结果表明，在低磷胁迫下PvPAP3在磷高效的菜豆基因型G19833中的表达量高于磷低效的基因型DOR364。在拟南芥和菜豆毛状根中过量表达PvPAP3显著提高了转基因材料对外界ATP的利用能力。以上结果说明了低磷胁迫条件下PvPAP3的表达参与了菜豆利用外源ATP的过程，这也可能是G19833能够高效吸收、利用外源磷的主要机理之一。由于PEG和盐害等渗透胁迫也能诱导PvPAP3的表达，PvPAP3是否具有参与植物抗其它逆境胁迫的生物学功能还有待进一步的研究。