野葛异黄酮合成酶基因的克隆、亚细胞定位及功能鉴定

• 作 者: 姜琳
• 机 构: 华南师范大学
• 出 处: 华南师范大学
• 发表日期: 2011年期
• 关键词: 异黄酮合成酶 基因克隆 亚细胞定位 活性成分 葛根素

野葛[Pueraria lobata(Willd)Ohwi.]是一种重要的药用植物,在分类学上归于豆科葛属,原产于东亚,主要分布于中国、日本和韩国。野葛的主要药用活性成分为葛根素、大豆甙、大豆甙元等异黄酮类(isoflavones)化合物,在生理药理方面具有特殊的功效:在生理方面,作为植保素抵抗病菌侵染；作为信号分子诱导根瘤菌合成Nod因子刺激根瘤形成。在药理方面,由于异黄酮的基本骨架3-基苯丙二氢吡喃与动物雌激素17β-雌二醇的结构相似,是一类天然植物雌激素,可以和雌激素受体结合发挥弱雌激素活性,能有效预防与激素相关的癌症发生,缓解女性更年期综合症。　　
葛根素是植物苯丙氨酸代谢途径的一类次生代谢物,其合成源自类黄酮生物合成途径生成的中间代谢物黄烷酮,催化黄烷酮进入异黄酮合成途径的第一步反应酶为异黄酮合成酶(isoflavone synthase,IFS)。为了在分子水平上了解异黄酮合成酶基因在野葛葛根素生物合成中的功能和作用机制,本文以野葛愈伤组织为实验材料,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技术,首次从野葛中分离克隆得到一个新的异黄酮合成酶基因,对该基因进行了序列分析和功能鉴定,旨在为今后研究该基因的功能、分子进化及次生代谢工程等奠定了基础。本文具体的研究结果如下:　　
1.从野葛的愈伤组织中克隆获得了IFS基因的全长cDNA序列,命名为PLIFS(GeneBank登录号:JF508438),其cDNA序列的全长为1910 bp。开放阅读框(ORF)的长为1566 bp,编码521个氨基酸。推导的PLIFS蛋白分子量为59.21kDa、等电点为9.04,含有异黄酮合成酶(IFS)所必需的保守氨基酸位点。SOPMA预测结果表明,PLIFS蛋白由48.75％的α-螺旋(α-helix)、11.90％的延伸片(extended strands)、4.41％的β-转角(β-turn)以及34.93％的无规则卷曲(random coil)所组成。核酸序列和氨基酸序列的同源序列比结果表明,PLIFS与其它植物已知的IFS基因序列同源性达80％以上,氨基酸序列同源性达90％以上,具有很高的同源性和共同的进化起源。对DNA序列分析结果表明,PLIFS基因具有一个大小为524bp的内含子,其外显子与内含子连接区符合经典简拼序列的GT-AG法则。　　
2.为了探讨PLIFS蛋白在植物细胞内的定位情况,构建了pBEGFP-IFS融合蛋白表达载体。根据GFP发光特性,在真实还原高分辨率彩色CCD(OLYMPUS QIMAGING Micropublisher5.0 RTV)下观察发现,pBEGFP-IFS蛋白定位于细胞质中,与在线软件的预测相一致。　　
3.构建了PLIFS基因的植物超表达载体,并通过发根农杆菌介导,侵染与野葛同科的大豆无菌苗,获得了转基因的大豆毛状根系,PCR检测证明目的基因已转入大豆的毛状根。