【摘 要】
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本试验病原为胰腺炎型DHAV-1(MPZJ1206株),其所引起的病变与典型的DHAV-1有所不同,主要引起雏番鸭发生病变,发病的雏番鸭胰腺可见发黄和出血。将胰腺炎型DHAV-1与GenBank中登
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本试验病原为胰腺炎型DHAV-1(MPZJ1206株),其所引起的病变与典型的DHAV-1有所不同,主要引起雏番鸭发生病变,发病的雏番鸭胰腺可见发黄和出血。将胰腺炎型DHAV-1与GenBank中登录的DHAV-1相比,发现其VP1基因核苷酸同源性在94.1%与99.1%之间,VP1基因推导氨基酸残基的同源性在96.8%与97.5%之间。本实验根据MPZJ1206株的VP1基因设计一对特异性引物,并采用RT-PCR法将目的VP1基因扩增,扩增产物回收纯化后,将其连接到克隆载体pMD18-T上,构建克隆载体pMD18-T-VP1,并将其转化到感受态细胞E.coli Trans5α。挑取单菌落,双酶切鉴定并测序,将鉴定为阳性的菌落提取质粒进行双酶切,回收VP1片段,将其与表达载体pGEX-6P-1进行连接。并将连接产物转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,鉴定同上,将鉴定为阳性的菌落经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳,并对其进行了鉴定。在此基础上对VP1蛋白的表达条件进行了优化。结果表明,表达的目的蛋白大小为53kDa,与预期相符,且具有反应原性,37℃诱导表达5h蛋白表达量达到最大,主要以包涵体的形式存在。将诱导表达的VP1蛋白作为抗原免疫BALB/C、鼠,共免疫四次。同时建立检测小鼠抗VP1抗体的间接ELISA检测方法。最后一次免疫后72h内取处于对数期生长的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合。融合后的杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选阳性克隆,并进行亚克隆,结果共获得的2株杂交瘤细胞株均能稳定分泌抗DHAV-1的VP1蛋白单克隆抗体,分别命名为1A2、5G3,并对其稳定性,小鼠腹水的效价等进行检测。本实验表明,两株单克隆抗体具有稳定性好,效价较高,特异性良好的特点。1A2株效价可达1：25×103,5G3株效价可达1：211×103。亚类鉴定结果显示,两株细胞均为IgG1、κ链抗体。Western-blot表明两株单克隆抗体是针对DHAV-1的VP1蛋白。本实验获得的单克隆抗体为DHAV-1的治疗以及研制试剂盒对其进行检测打下了基础。
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