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白僵菌（Beauveria）是应用和研究最广的昆虫病原真菌之一，也是目前微生物农药的研究热点之一。白僵菌对害虫致病性强、对环境适应性强、杀虫范围广，不伤害其他天敌昆虫和有益生物，可以有效地与其它杀虫因子协同作用并维持物种的多样性，容易大量生产、无残毒、害虫不产生抗性，相对于传统化学农药，有着无可比拟的优势。但作为一种昆虫病原真菌，白僵菌同时也存在着杀虫速度慢、效率低、防治效果不稳定等缺点，大大影响了其杀虫效果。昆虫病原真菌通过体壁接触感染导致害虫死亡，在侵染昆虫体壁过程中分泌一系列胞外水解酶如蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶、纤维素酶等，形成一个相互作用的复杂体系，降解昆虫体壁并主动引起昆虫致病直至死亡。其中，类枯草杆菌蛋白酶（subtilisin-like protease，Pr1）在降解昆虫体壁并激活昆虫免疫自毒体系，引起害虫致病过程中起主要作用，是其重要的毒力因子。已有研究证实，通过增加Pr1基因的拷贝数，提高表达水平，并改变其为组成型表达模式，可明显提高转化体的杀虫毒力。 利用基因工程技术对菌株进行改良，构建高酶活高抗性的白僵菌工程菌，提高毒力因子的活性，并加强白僵菌致病分子机理的研究，对充分实现该菌的生物防治作用具有重要意义。目前，国内外对白僵菌表皮降解蛋白酶基因的研究主要集中在对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的研究上，而对布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）表皮降解蛋白酶基因的研究未见报道。由于布氏白僵菌侵染昆虫有其特定的寄主谱，因而有必要开展布氏白僵菌杀虫毒力分子生物学的研究。 本课题在本实验室前期克隆得到的布氏白僵菌Pr1蛋白酶基因序列和cDNA序列的基础上展开。主要内容包括： ①根据布氏白僵菌Pr1基因全长cDNA序列设计引物，以含有Pr1基因全长cDNA的质粒pGEM-T-Pr1cDNA为模板，PCR扩增得到含有Pr1基因ORF序列的DNA片段。构建了重组质粒pBV220-Pr1cDNA ORF（6XHis），并导入大肠杆菌XLOLR。通过重组Pr1蛋白酶包涵体纯化和变性溶解，镍离子螯和柱纯化，透析复性等一系列处理，酶活测定结果表明，成功实现了布氏白僵菌Pr1蛋白酶基因在E.coli中的表达，其比酶活为0.288 U mg-1蛋白。 ②建立了根瘤农杆菌介导的布氏白僵菌遗传转化体系。将草丁磷除草剂抗性bar基因作为筛选标记，构建了含丝状真菌组成型bar基因表达元件的根瘤农杆菌Ti质粒，建立了根瘤农杆菌双元载体体系，并对影响转化效率的