【摘 要】
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人血清淀粉样蛋白A1是人血清淀粉样蛋白A(SAA)的家庭的一员,目前,细菌、病毒感染、冠心病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病中均检测到血清SAA增加。作为新型炎症标志物,SAA对于临
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人血清淀粉样蛋白A1是人血清淀粉样蛋白A(SAA)的家庭的一员,目前,细菌、病毒感染、冠心病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病中均检测到血清SAA增加。作为新型炎症标志物,SAA对于临床疾病中的监测具有重要的引导和应用意义。本文采用大肠杆菌BL21(DE3)原核系统表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,经表达条件优化,获得重组目的蛋白的最佳诱导表达条件:诱导剂IPTG终浓度为0.6 mM,34℃,诱导8 h,培养基pH7,诱导转速180rpm。过Ni柱纯化浓缩蛋白,得到纯度高达95%以上,最终浓度为8.09 mg/mL的SAA1蛋白。本文利用抗原与抗体的特异性结合,建立了SAA1的酶联免疫(ELISA)检测方法和比浊检测方法。通过试验对反应条件以及实验用耗材和试剂来进行优化,达到最佳检测效果。对检测试剂的敏感性、重复性和特异性进行评估,建立了ELISA检测方法,确定了阳性样品的临界值OD450 nm=0.222,线性范围在100-2400 ng/mL之间,最低检出限为50 ng/mL。性能评估显示出了本检测试剂特异性良好,批内以及批间变异系数均小于7%,回收率均在允许范围内且平均回收率为99.91%,精密度高。同时,成功建立了比浊检测方法。在紫外分光光度计560 nm下检测其吸光值与加入SAA1蛋白含量呈线性相关,其标准方程是Y=0.0698ln(X)+0.255,线性范围是0.075-2.4μg/mL,其相关系数R2=0.99287,其回收率在93.6%-106.4%之间,均在允许范围内。
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