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水稻是世界上最为重要的一粮食作物,其化感作用的研究也成为研究的热点问题。试验表明从水稻中分离出的酚酸类物质和稻壳酮(momilactones)在水稻的化感作用中起了很重要的作用,但其活性的确定采用了药理学的方法。RNA干涉技术是通过对特定基因沉默或下调来研究植物基因功能的一种方法,此方法的优点在于可以只改变目标基因,而不改变植物的其他遗传背景。OsCYC1是稻壳酮合成关键调控基因,OsPAL是酚酸类物质合成的关键调控基因,而OsAOS是调控茉莉酸合成的关键调控基因,试验利用RNA干涉技术OsCYC1和OsPAL在子代中沉默,分析稻壳酮生物合成的关键调控基因OsCYC1表达量以及酚酸与水稻化感活性的关系,并进一步揭示OsCYC1表达量与水稻对稻瘟病抗性的关系;同时利用RNA干涉技术使OsAOS在子代中下调表达,阻断茉莉酸信号途径,研究逆境胁迫下水稻化感作用的升高是否是因为茉莉酸信号途径的启动。
主要研究结果如下:
1.OsPAL干涉载体的构建以及遗传转化试验
成功构建了酚酸类物质生物合成关键调控基因OsPAL干涉载体,并进行了遗传转化工作。
2.OsCYC1干涉材料相关的试验结果
1)化感活性与OsCYC1表达量:比较了石狩白毛、强化感品种IAC1423和弱化感品种IR46的化感活性的差异。生测结果表明,石狩白毛和IAC1423一样都具有强的化感活性;基因分析与相关性分析结果表明水稻的化感活性与OsCYC1表达量显著正相关。
2)OsDTS2的表达量:Real-time PCR结果表明,OsCYC1表达量下调的水稻植株中位于OsCYC1下游的稻壳酮合成另一关键调控基因OsDTS2的表达量也下调,并且二者之间存在显著正相关。表明上述干涉材料中OsCYC1表达量的确下调。
3)茉莉酸甲酯、水杨酸和紫外处理对干涉和未干涉水稻OsCYC1、OsDTS2表达的影响Real-time PCR结果表明OsCYC1和OsDTS2基因在RNAi-C中的表达量显著低于在No-RNAi中的表达量,经MeJA、UV-C和SA处理后,这种现象更加明显。
4)化感活性结果:将干涉水稻和未干涉水稻分组后分别经MeJA、UV-C和SA处理,另一组做对照,检测其化感活性。生物测试结果表明:
A.MeJA和SA处理提高了No-RNAi水稻的化感活性但对RNAi-C水稻的化感活性没有显著影响,UV-C提高了No-RNAi水稻和RNAi-C水稻的化感活性;
B.OsCYC1表达量的下调结果使水稻对稗草根和油菜的化感抑制效应减弱。MeJA、SA、UV-C处理后,这种减弱更为明显;
C.稗草根长和苗与OsCYC1表达量的显著负相关表明,水稻OsCYC1表达量越高,水稻浸提物对稗草的抑制作用越强,水稻的化感活性越强。
5)稻瘟病抗性结果:将干涉水稻和未干涉水稻分组后分别经MeJA和SA处理,另一组做对照,检测其对稻瘟病的抗性。此外,将No-RNAi水稻也做上述相同的处理。抗性分析结果表明:
A.与No-RNAi水稻比较,干涉后RNAi-C水稻对稻瘟病抗性显著下降;
B.经MeJA、SA处理后,No-RNAi和RNAi-C水稻对稻瘟病的抗性都明显上升。但RNAi-C抗性级别上升幅度低于No-RNAi:
C.水稻OsCYC1表达量越高,水稻对稻瘟病的抵抗能力越强。
3.OsAOS干涉材料相关的试验结果
1)OsOPR的表达量:Real-time PCR结果表明,OsAOS表达量下调的水稻植株,中位于OsAOS下游的茉莉酸合成另一关键调控基因OsOPR的表达量也下调,并且二者之间存在显著正相关。表明上述干涉材料中OsAOS表达量的确下调。
2)化感活性结果:将干涉水稻和未干涉水稻分组后分别经干旱胁迫(Dry)、N胁迫(N-)、机械损伤(Dm)和紫外(UV-C)处理,另一组作为对照,检测其化感活性。生物测试结果表明:
A.RNAi-A水稻在经Dry、N-、Dm处理后其化感活性没有显著变化,但No-RNAi水稻的化感活性却升高;RNAi-A水稻如同No-RNAi水稻一样在UV-C处理后二者的化感活性都急剧升高;
B.Dry、N-、Dm和UV-C处理后,RNAi-A水稻对稗草的化感活性显著低于No-RNAi;
C.进一步利用茉莉酸信号途径抑制剂SHAM进行处理,经过SHAM+Dry,SHAM+N-,SHAM+Dm,SHAM+UV-C处理后,No-RNAi水稻的化感活性显著低于相应的仅仅用Dry、N-、Dm、UV-C处理后产生的化感作用。SHAM处理对未经历胁迫的No-RNAi水稻的化感活性没有显著影响; D.油菜和稗草的根和苗与OsAOS达量的相关分析表明水稻OsAOS达量越高,水稻浸提物对稗草的抑制作用越强,水稻的化感活性越强。
3)缺氮、机械损伤和紫外线处理对OsAOS表达的影响:在N、Dm、UV-C处理36,36和3d,时后(此为上述三种处理对茉莉酸生物合成关键调控基因OsAOS的最佳诱导时间)比较了OsAOS在RNAi-A和No-RNAi水稻中表达量的差异,结果发现这些处理都能提高OsAOS在RNAi-A和No-RNAi水稻中的表达量,但OsAOS在RNAi-C中的表达量显著低于在No-RNAi中的表达量。
4)茉莉酸信号途径相关基因的表达量:Real-time PCR结果表明,RNA干涉导致的OsAOS基因在水稻叶片表达量的下调不影响OsCYC1,OsOASA2,OsFPS,OsPAL在水稻叶片中的正常的表达;但RNAi-A和No-RNAi水稻经历Dry、N-、Dm和UV-C胁迫后,OsCYC1,OsOASA2,OsFPS,OsPAL在RNAi-A中的表达量要显著低于在No-RNAi水稻中的表达量(除Dm处理后OsPAL,OsFPS基因),可见由茉莉酸信号途径引发的OsCYC1,OsOASA2,OsFPS,OsPAL表达量的升高对水稻化感作用的升高有重要作用。