论文部分内容阅读
食源性致病菌污染食品可导致多种疾病的暴发与流行，严重威胁人类的健康。因此，若想有效控制食品细菌性疾病的发生，快速而准确地检测食品中致病菌是关键的技术基础之一。本研究以副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特菌、大肠杆菌O157: H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌等常见的污染食品的致病菌为研究对象，建立了8种食源性致病菌的双重PCR检测方法，同时进行了基因芯片检测的基础研究，并对阪崎肠杆菌展开免疫磁珠吸附方法的研究。研究结果对常见致病菌的检测提供了新的方法和思路。
1、建立了8种食源性致病菌检测的双重PCR方法。通过选择特异性的基因，参考文献或者自行设计了引物，对所优化的双重PCR方法进行了特异性和敏感性的研究。每种致病菌都出现各自特异的条带。检测限分别为：副溶血性弧菌2.876 pg、单核细胞增生性李斯特菌0.8769 ng、大肠杆菌O157：H791.35 pg、金黄色葡萄球菌0.1197 ng、沙门氏菌0.1332 pg、志贺氏菌7.783 pg、阪崎肠杆菌12.19 pg和小肠结肠炎耶尔森氏菌15.5 pg。
2、初步研究了8种食源性致病菌的基因芯片检测方法。利用Array Designer2.0软件自行设计并比对各种致病菌特异性基因的探针(20±2 bp)，按设计好的阵列打印到芯片片基上。对双重PCR产物进行单引物PCR Cy3荧光标记，95℃变性后，于52℃杂交2.5 h，芯片扫描仪扫描。从设计的56条探针中筛选出37条特异性探针，各种致病菌在相应的探针位置出现特异的荧光信号。
3、建立了阪崎肠杆菌免疫磁珠分离方法。制备阪崎肠杆菌ATCC51329标准株的兔抗多克隆免疫血清，玻片凝集实验证明该血清对阪崎肠杆菌两个标准株(ATCC51329和ATCC29544)和15个实验室分离株产生强凝集反应；赫氏肠杆菌和阴沟肠杆菌的分离株产生弱凝集反应；大肠杆菌( ATCC25922)、大肠杆菌O157：H7(NCTC12900)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC50115)和宋内氏志贺氏菌(CMCC51592)没有凝集。制备免疫磁珠，2株标准菌株验证敏感性为10CFU/ml。在干扰菌沙门氏菌和阴沟肠杆菌存在条件下，没有影响免疫磁珠的最低吸附限。从全国不同城市采集342份婴幼儿奶粉样品，先以我国行业标准( SN1632.2-2005)中的单重PCR方法对其筛选阪崎肠杆菌疑似阳性样品，结果有37份奶粉中有282 bp条带产生。利用所建立的免疫磁珠分离方法对37份疑似阳性样品增菌液进一步分离，涂布阪崎肠杆菌显色培养基平板，用API20E检测系统鉴定，结果有11份证实为阪崎肠杆菌阳性。应用作者所建立的阪崎肠杆菌双重PCR方法和我国行业标准(SN1632.1-2005)中的传统方法作为对照，阳性结果分别为16份和5份。此方法为阪崎肠杆菌的检测提供了一个新的思路，节约了人力和物力，提高了工作效率和阳性样品的检出率。