母猪怀孕11-12天子宫内膜差异表达基因的筛选与分析

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母猪妊娠11-12天(GD11-12)期间的胚胎死亡是影响窝产仔数和生产效益最重要的因素。中国梅山猪的产仔数平均每窝比美国猪种多3-5头,而二花脸的产仔数比梅山猪还高。研究指出梅山猪高产是由母体的基因型而不是胚体的基因型所决定的,而且GD11-12期间梅山猪胚胎存活率高于外种猪,但未有其分子机制的系统研究报告。因此,研究二花脸(ER)母猪GD11-12期间高胚胎存活率的分子机制对提高母猪的窝产仔数和工厂化养猪生产的经济效益都有重要的意义。本研究以三头怀孕第三胎的ER母猪和三头怀孕第三胎的长白大白杂交母猪(LL)为研究对象,以GD11-12期间出现了丝状胚时的子宫内膜为试验样本,采用数字基因表达谱(DGE)标签测序技术对两猪种GD11-12期间子宫内膜分别进行高通量的转录组测序,然后通过生物信息学技术对标签测序所得结果进行系统的评定和深入的分析;在实验筛选内参基因的基础上通过相对定量PCR技术验证了所得数字基因表达谱结果的充分可信后,对差异表达谱中可能影响早期胚胎存活率和母猪窝产仔数的基因和通路进行了系统的阐释和讨论。取得主要研究结果和结论如下:   1.采用DGE技术,成功地构建了ER和LL妊娠11-12天期间子宫内膜的全基因组表达谱。标签分布统计和饱和度分析结果证明了表达谱标签测序结果的总体质量达到要求。通过比较所得的ER和LL表达谱数据筛查到了13612个差异表达基因(P<0.001,FDR<0.001且|log2(变化倍数)|>2),这些差异表达基因主要参与了花生四烯酸代谢、粘连、胞外基质与受体的互作、局部附着、叶酸合成等;反义基因的注释表明在ER中有13966个基因转录了反义链,占该品种中该组织此时表达基因总数目的约44.72%,而在LL中检测到了11033基因的反义链转录本,占该品种中该组织此时表达基因总数目的约24.39%;新转录本的检测结果显示本实验ER和LL中有约12%-18%的非同种标签(distinct tags)无法比对到目前已知基因的转录本上,但能比对到线粒体基因组或核非编码基因组中,这表明目前的猪核非编码基因组序列中的许多位置都可能存在新基因或新转录本,但有待进一步的实验验证。   2.运用绝对定量PCR技术筛选合适内参,geNorm和SAS的分析结果显示:在GD11-12期间的子宫内膜中,一些常用的内部参照基因(如ACTB、B2M)虽然在品种内不同个体间的变异比较小,但是在品种间的变异比较大,因此这些持家基因并不适合用于品种间的基因表达量比较研究;而另外一些较少使用的内部参照基因(如RPS20和RPG)在不同猪种间的变异较小,尤其是RPS20是最适合用于GD11-12期间ER与LL间基因表达量比较研究的内部参照基因。   3.以RPS20为内参基因所进行的相对定量PCR发现:DGE与qPCR结果的一致性高,证明了本实验所得DGE结果的可信度很高。   4.差异表达基因的GO功能聚类和通路分析显示ER母猪早期胚胎存活率较LL高的主要分子基础在于前列腺素E2的累积、子宫的粘附性和接受态、子宫内膜分泌营养素和生长因子对胚体的促生长作用、附植的免疫调控等方面,这些因素对早期胚胎存活率的影响是造成两猪种窝产仔数差异的重要原因。
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