【摘 要】
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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等相关疾病的重要病原。该病已在全球各地区的猪群中广泛分布,给全球养殖业造成了巨大
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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等相关疾病的重要病原。该病已在全球各地区的猪群中广泛分布,给全球养殖业造成了巨大的经济损失。疫苗接种是当前防控该病传播的有效措施之一。市场上现有圆环病毒疫苗只能一定程度上控制猪群圆环病毒病的阳性率和缓和阳性猪群的临床症状,不能从上根本阻断病原的传播。铁蛋白(ferritin,F),广泛分布在各种生物体中,其主要作用是调节生物体内铁离子含量,为生物体营造一个平衡的铁离子环境。由于其具有可以自组装成壳状纳米结构和易被机体降解吸收的特性,常被用于药物递送载体、医学造影成像诊断、纳米生物传感器等领域。此外,有研究表明转铁蛋白由于其内部羧基端和外部环状结构都有潜在的位点供各种各样的多肽和小蛋白抗原插入,所以可以作为一个从基因角度引入多肽类抗原至其内部或外部的纳米蛋白递呈系统。本研究拟构建F-Cap重组表达载体,验证Cap蛋白与铁蛋白融合表达的效果,并探索重组蛋白的理化性质和生物活性等,为下一步新型高效疫苗的研发提供试验基础。本研究首先对带促溶标签的若干表达载体和F-Cap基因多克隆位点的核苷酸序列进行分析,从中选择6种促溶效果较好的载体,设计Bam HⅠ和XhoⅠ两个限制性内切酶位点用于重组蛋白的表达载体的构建;运用PCR和酶切的方法获得F-Cap目的基因片段后,用T4连接酶将目的基因与6个带不同标签的相同酶切载体相连,转入大肠杆菌DH5α,扩大培养后提取质粒;对相应的重组质粒进行双酶切鉴定,然后对酶切鉴定成功的重组质粒进行基因序列测定,测序鉴定成功后将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,对有表达的细菌进行超声破碎,离心后取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳二次鉴定。实验结果表明,6种重组质粒都有目的蛋白表达,其中有3种重组质粒所表达的目的蛋白主要集中在上清中。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱对目的蛋白进行亲和纯化,TEV酶切,去掉重组蛋白亲和标签,获得目的蛋白。目的蛋白进行二次纯化和热处理,透射电镜观察。结果显示得到了相对纯净的目的蛋白。本研究为后续该蛋白的功能研究和新型PCV2疫苗开发奠定了实验基础。
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