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背景及目的肠上皮屏障(Intestinal Epithelial Barrier，IEB)是机体抵御外部环境最重要的防御屏障。它在消化吸收各种营养物质、水分及电解质的同时，还能够抵御肠道内的大量细菌及其产物的入侵，维持机体内环境的相对稳定。这一防御系统主要有机械、免疫、生物、化学屏障四大部分组成，其中机械屏障是维持肠道屏障功能最重要的结构基础。其结构的破坏可导致肠道屏障功能障碍，引起细菌移位，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，甚至引起脓毒症、多器官功能不全乃至多脏器功能衰竭(Multiple OrganDysfunction Syndrome，MODS)。干扰素-(interferon-，IFN-γ)作为肠上皮间淋巴细胞(Intestinal Intraepithelial lymphocytes，iIEL)产生的重要的炎性介质，在肠上皮屏障的损害过程中发挥重要作用，然而其具体机制仍未阐明。缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白，在机体缺氧代偿性反应过程中能发挥重要作用。HIF-1对于缺血缺氧坏境中细胞能量代谢、离子代谢、儿茶酚胺代谢、血管收缩控制以及新生血管的生成、肿瘤细胞的凋亡等方面均具有重要的作用。近来有研究表明，在缺氧，缺血再灌注以及炎症过程中HIF-1α扮演一种肠粘膜屏障破坏者的角色。目前已经证明HIF-1α不仅能在低氧条件下活化，而且能在各种非低氧刺激下(包括各种炎症介质和细胞因子)活化。HIF-1α的这些非低氧刺激的一个共同机制在于都涉及到NF-κB依赖的HIF-1α水平的上调。最近的研究表明IFN-γ可通过多种途径参与HIF-1α的转录调节。另外，对IFN-γ信号通路进行研究发现，IFN-γ可以以非STAT-1依赖的方式激活NF-κB。由于IFN-γ和HIF-α都在肠上皮屏障功能损害中发挥重要作用，但两者在这一过程中的关系尚未明确。因此，本课题拟应用蛋白印迹、qRT-PCR、激光共聚焦、跨上皮电阻测定等技术，探讨在IFN-γ对肠上皮细胞中NF-κB、HIF-1α的活化影响，以及对维持肠上皮屏障功能起关键作用的紧密连接蛋白(Tight Junction，TJ) Claudin-1、Claudin-2、Occludin、ZO-1的表达及形态学的变化，并通过测定跨上皮电阻(Transepithelial resistance，TER)，阐明NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ诱导的肠上皮屏障损害中的作用及机制，进而为肠上皮屏障的损伤及修复机制提供新的理论依据。方法1.建立肠上皮细胞系T84缺氧及IFN-γ干预模型，通过qRT-PCR及蛋白印迹技术(Western blot，WB)分别检测缺氧条件及IFN-γ干预情况下肠上皮细胞HIF-1α的表达变化及不同浓度和不同干预时间下IFN-γ对HIF-1的表达影响。2.建立肠上皮细胞系IFN-γ干预模型，通过激光共聚焦技术检测IFN-γ干预前后HIF-1α在肠上皮细胞T84细胞质、细胞核的表达变化；并通过WB技术检测IFN-γ对肠上皮细胞T84中NF-κB活化的影响，并利用NF-κB抑制剂吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrolidinedithiocarbamate，PDTC)明确NF-κB在IFN-γ诱导的HIF-1α中的作用。3.通过Transwell小室细胞培养建立体外单层肠上皮细胞系IFN-γ干预模型，结合NF-κB抑制剂PDTC及HIF-1α抑制剂YC-1，进行跨上皮电阻(Transepithelialresistance，TER)测定技术，明确NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ诱导的肠上皮细胞TER变化中的作用。同时通过WB及激光共聚焦技术，检测IFN-γ对肠上皮细胞中TJ蛋白表达及形态学变化的影响，进一步探讨NF-κB/HIF-1α通路在IFN-γ诱导的肠上皮屏障损伤中的作用及机制。主要结果1.缺氧和IFN-γ处理均可引起T84肠上皮细胞HIF-1α蛋白表达增加，并且IFN-γ诱导的HIF-1α蛋白增加是呈时间和浓度依赖性的，但HIF-1蛋白的表达不随IFN-γ处理时间和浓度的变化而改变。2. IFN-γ处理不仅可使T84肠上皮细胞中HIF-1α蛋白表达增加，而且促进HIF-1α进入细胞核发挥生物学功能。3. IFN-γ处理能活化T84肠上皮细胞中的NF-κB信号通路，NF-κB抑制剂PDTC则可抑制这一作用；同时，NF-κB抑制剂PDTC还能抑制IFN-γ诱导的HIF-1α蛋白表达的增加。4. IFN-γ处理可引起T84肠上皮细胞TER呈浓度和时间依赖性的降低，NF-κB抑制剂PDTC及HIF-1α抑制剂YC-1则可抑制IFN-γ诱导的TER降低。5. IFN-γ处理可引起T84肠上皮细胞TJ蛋白Claudin-1和ZO-1的表达下降，Claudin-2表达增加，并破坏其形态学结构；NF-κB抑制剂PDTC及HIF-1α抑制剂YC-1均可减弱IFN-γ引起的TJ蛋白的变化及形态学改变。结论1. IFN-γ可引起T84肠上皮细胞中HIF-1α蛋白随时间和浓度依赖性的增加，但不改变HIF-1蛋白的表达；同时IFN-γ处理还促进HIF-1α蛋白在细胞核内表达增加，提示IFN-γ可以诱导HIF-1α蛋白活化，并入核发挥生物学功能。2. IFN-γ处理能活化T84肠上皮细胞中的NF-κB信号通路，NF-κB抑制剂PDTC则可抑制这一作用；同时，NF-κB抑制剂PDTC还能抑制IFN-γ诱导的HIF-1α蛋白表达的增加，提示IFN-γ通过NF-κB信号通路参与了HIF-1α表达的调节。3. IFN-γ可引起T84单层肠上皮细胞TER的降低，并使细胞TJ蛋白Claudin-1和ZO-1的表达下降，Claudin-2表达增加，并破坏其形态学结构；而NF-κB抑制剂PDTC及HIF-1α抑制剂YC-1均可减弱IFN-γ引起的跨上皮电阻TER的降低，TJ蛋白的变化及形态学改变。这表明IFN-γ通过NF-κB/HIF-1α通路参与了对肠上皮细胞紧密连接表达的调控，进而影响了肠上皮屏障功能。