论文部分内容阅读
人类mas基因编码的蛋白MAS是一种G蛋白偶联受体，是血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]的内源性受体。MAS参与了Ang-(1-7)抗血管平滑肌细胞增殖、抗利尿及血管扩张等作用。然而，目前对MAS复杂、广泛的生理作用尚未完全了解，仍需进一步研究，迄今尚未见任何有关MAS结合蛋白的研究报道。
不同种属，包括人，大鼠，小鼠及狗的MAS蛋白羧基末端含有一段高度保守的氨基酸序列-ETVV，该序列符合可以与PDZ蛋白质相互作用的PDZ结合结构域的通式(E-S/T-X-I/LV)，推测MAS通过此结构域可与某些PDZ蛋白发生相互作用。
本研究应用GST pull down技术筛选了兔脑组织中的MAS结合蛋白，确定其中之一是蛋白质PSD95(postsynaptic density protein 95，突触后致密物质-95)，并对二者的相互作用作了如下研究：(1)利用GST融合蛋白沉降(GST pull down)，免疫共沉淀(co-IP)，免疫荧光等方法对其相互作用及作用的特异性进行了研究；(2)采用RT-PCR、Western blot等方法探讨了二者相互作用对MAS受体表达的影响。结果如下：
1，GST pull down技术从兔脑组织中筛选到多种MAS结合蛋白。构建GST-MAS羧基末端融合蛋白(GST-MAS-CT)的原核表达载体，在细菌中诱导表达，获得纯化的GST-MAS-CT融合蛋白，用上述纯化的融合蛋白pull down兔脑组织，所得沉淀复合物经SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色，结果显示有多种特异性结合蛋白质条带，其中以分子量为～30KD(P30)，～45KD(P45)，～50KD(P50)，～70KD(P75)和～97KD(P97)的条带较为显著，而在GST蛋白pull down兔脑组织的沉淀复合物中，或检测不到上述蛋白质条带，或相应蛋白质条带非常模糊。用Western blot对pull down复合物进行鉴定，结果发现：在GST-MAS-CT pull down复合物中存在PSD95，而在GST pull down复合物中不存在PSD95。表明PSD95是兔脑组织中一种能与MAS羧基端特异结合的蛋白质。
2，MAS与PSD95相互作用及作用特异性的研究
1)采用GST pull down技术研究MAS羧基端(MAS-CT)与PSD95相互作用的特异性，结果显示：野生型GST-MAS-CT pull down复合物中能够检测到PSD95；GST-MAS-CT四种突变体puLL down复合物中检测不到PSD95。表明MAS-CT可通过其PDZ结合结构域与PSD95特异性结合。
2)采用GST puLL down技术研究MAS-CT与PSD95各PDZ结构域之间相互作用的特异性，结果显示：野生型GST-MAS-CT puLL down复合物中能检测到PSD95的PDZ1+2和PDZ3结构域蛋白。表明GST-MAS-CT能与PSD95的三个结构域特异结合。GST-MAS-CT四种突变体pull down复合物中未检测到PDZ1+2和PDZ3结构域蛋白。表明GST-MAS-CT可通过其PDZ结合结构域与PSD95的三个PDZ结构域特异性结合。
3)采用免疫共沉淀技术(co-IP)验证兔脑组织中MAS与PSD95之间的相互作用，结果发现在PSD95抗体的免疫沉淀复合物中可检测到MAS，而在未加入PSD95抗体的沉淀复合物中未能检测到MAS。表明兔脑组织中PSD95与MAS能相互作用。
4)采用激光共聚焦显微镜(confocal)观察MAS与PSD95在细胞内的共定位，结果显示：野生型MAS与PSD95可以在细胞浆内共定位，而MAS羧基端最末一位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸后的突变体(MAS V325A)不能与PSD95共定位。表明MAS可通过其羧基末端特定氨基酸与PSD95特异性结合，将其突变后，MAS不能与PSD95结合，从而影响了二者的共定位。
3，RT-PCR、Western blot技术探讨PSD95对MAS表达的影响
1)将PSD95的基因与mas转染到HEK293细胞中，观察PSD95对MAS表达的影响。在外源基因mas转染量不变情况下，逐渐增加PSD95基因转染量，可见MAS蛋白质表达量逐渐增高，而在与空载体共表达的对照组中观察不到此种变化；光密度扫描结果显示两组存在显著性差异(P＜0.05)。表明PSD95可以促进MAS的表达。
2)采用RT-PCR技术在RNA水平上探讨PSD95对MAS表达的影响，结果显示：共同转染PSD95基因与mas组中MAS蛋白的RNA量和与空载体共同转染的对照组相比无统计学意义(P＞0.05)。表明PSD95不是通过促进MAS转录水平的表达来促进MAS蛋白水平的表达。
本研究发现：(1)MAS能与兔脑组织中多种蛋白质发生相互作用；(2)MAS能特异性与PSD95作用，二者相互作用是通过MAS羧基术端与PSD95的PDZ1+2、PDZ3结构域相结合实现的；(3)MAS与PSD95的相互作用可影响PSD95在细胞内的定位；(4)MAS与PSD95的相互作用未影响MAS转录水平的表达，但可见MAS蛋白表达水平增加。我们认为，PSD95可通过与MAS特异性结合影响MAS的功能。