小麦条锈菌细胞壁相关基因的寄主诱导转基因沉默研究

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小麦条锈病是世界范围内威胁小麦生产的重要病害之一。鉴定小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)生长发育的关键基因,深入理解条锈菌与寄主的互作机理,对于开发新的生物技术、培育抗病品种具有重要意义。近年来,小麦条锈菌及其它锈菌全基因组测序的完成,为锈菌功能基因组学研究提供了重要基础。然而,由于条锈菌属于严格的活体营养型真菌,而且缺乏有效的遗传转化方法,其功能基因组学研究进展较慢。寄主诱导转基因沉默(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)技术是近年来发展的病原菌目的基因功能研究的分析方法。通过在植物中异源表达病原菌目标基因的双链RNA,可借助植物的RNAi系统,特异沉默入侵病原中目标基因的表达。通过HIGS研究,既可以从反向遗传学方向研究植物专性寄生病原菌的基因功能,也可以培育转基因作物改良抗病性。目前已在小麦赤霉病、白粉病等病害研究中取得了较好的效果。细胞壁是小麦条锈菌等丝状真菌的必需结构,既保证真菌的正常生长,又参与植病互作,因此是防治真菌病害的一个理想靶标。本研究利用小麦条锈菌基因组序列,对条锈菌几丁质脱乙酰基酶基因(chitin deacetylase,CDA)进行了注释与克隆,并分析了其在锈菌侵染不同时期的表达模式。构建了CDA基因的HIGS沉默载体,并获得了小麦品种Bobwhite与CB037的转基因株系,为进一步分析小麦条锈菌CDA基因在小麦-锈菌互作中的功能奠定了基础。主要研究结果如下:(1)小麦条锈菌CDA基因的注释:利用小麦条锈菌PST78全基因组序列,进行了CDA基因的序列比对与注释。通过以小麦条锈菌CRY32的cDNA进行PCR扩增与测序,对CDA基因进行了gap填充与注释校正。结果共注释20个CDA基因,均含有一个保守的polysaccdeac1结构域。对CDA基因进行进化树分析,可将其分为3个主要分枝,其中两个分枝内部分别存在多个串联重复基因簇。(2)小麦条锈菌CDA基因的表达分析:利用半定量RT-PCR技术,对小麦条锈菌侵染小麦辉县红后的9个时间点进行了表达检测。结果表明CDA基因在侵染72小时后,表达量均显著下降;侵染后10天左右,各个基因的表达量均达到最低值,多数基因未检测到明显表达。另外,个别基因在表达水平或表达模式上存在差异。(3)RNAi沉默载体的构建与小麦遗传转化:针对19个CDA基因,共构建了23个RNAi沉默表达载体。利用基因枪转化法,开展了普通小麦的遗传转化,并获得了其中10个基因的转基因后代。(4)锈菌诱导型启动子的克隆与验证:利用大麦类萌发素基因HvGER4c进行了小麦同源基因的序列比对与拼接,并克隆了小麦TaGER4c基因的启动子,NCBI登录号KR817251-KR817253。构建了报告基因GFP的融合表达载体,并开展了短柄草遗传转化。对转基因材料进行了锈菌接种、报告基因的表达分析与荧光检测,结果表明,TaGER4c启动子主要在叶片中表达,并且可响应锈菌的诱导而增强表达。
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