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印楝素具有很好的昆虫生长发育抑制活性,研究其对昆虫组织发育的影响对于阐明植物源杀虫剂作用机理具有重要意义。本文利用模式昆虫黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)从分子水平上研究了印楝素生长发育抑制的机理,运用显微研究、荧光观察、扫描电镜观察、透射电镜观察等技术方法,从经典形态学等方面确证了印楝素对黑腹果蝇复眼组织具有细胞凋亡诱导作用,并从凋亡重要相关基因角度,初步探讨了印楝素诱导复眼组织细胞凋亡的作用机制。论文研究结果为从诱导昆虫组织细胞凋亡作用角度探讨印楝素生长发育调节机制提供了新途径,为从分子水平深入研究植物源杀虫剂作用机理,寻找害虫防治新靶标,创制高效诱导昆虫组织细胞凋亡的新型农药提供理论基础。
生物活性测定结果表明,0.50~5.00 mg/kg印楝素处理可显著抑制黑腹果蝇幼虫的生长发育,处理后Sd平均虫重由CK的1.41 mg/头降低至1.13~0.38 mg/头,发育历期由CK的4.50 d延长至5.17~12.33 d,发育抑制率为19.86%~73.05%,有的甚至形成永久性幼虫,最终死亡;部分幼虫虽然能化蛹,但化蛹率T降至1.67%~63.33%,均显著低于对照组的95.00%,羽化率由CK的95.00%下降至63.33%~1.67%,平均产卵量由CK的57.33卵/雌下降至29.67~4.33卵/雌。印楝素处理后导致65%(N=60)的试虫羽化为畸形成虫,处理组与对照组相比,复眼明显变小,畸形,甚至未形成复眼。扫描电镜观察结果表明:2.00 mg/kg印楝素处理后导致成虫复眼呈现出一系列典型的畸形症状,如刚毛丛生、丢失,单眼不同程度丢失甚至未形成复眼等。
经典形态学观察结果表明,印楝素处理能够明显诱导果蝇复眼组织细胞凋亡。荧光显微镜观察结果表明,在2.00 mg/kg印楝素处理下,胚胎发育14~18 h时凋亡现象最明显,且主要发生在头部,明显推迟果蝇胚胎细胞凋亡高峰期,缩短凋亡峰期的持续时间。透射电镜结果表明,2.00 mg/kg印楝素处理后均出现凋亡典型的形态学特征,如染色质凝聚,吞噬泡增多,核膜皱缩等,同时凋亡引起了复眼中光感受器细胞不同程度的丢失。根据半定量PCR检测结果初步推断可能是由于印楝素处理引起果蝇复眼发育相关基因rpr、hid和grim的mRNA表达量变化所致。
结合已有相关研究报道,本论文运用实时荧光定量PCR技术对复眼发育相关基因rpr、hid和grim的mRNA表达量进行测定,结果显示,在胚胎发育16 h时,印楝素处理前后rpr基因较其它基因相对表达量最大,达到CK的15.03倍,在胚胎发育20 h时,rpr、hid和grim三个基因mRNA的表达量分别是CK的12.10倍、10.43倍和10.97倍,说明在黑腹果蝇胚胎发育时期rpr基因表达量受印楝素影响最大。在幼虫2龄期,与其它基因相比,印楝素处理前后hid基因的相对表达量最大,达到CK的10.34倍,说明在黑腹果蝇幼虫发育阶段hid基因表达量受印楝素影响最大。在老熟蛹期,印楝素处理前后grim基因较其它基因相对表达量最大,是CK的9.12倍,说明在黑腹果蝇蛹发育时期grim基因表达量受印楝素影响最大。以上结果表明,印楝素处理对三个基因mRNA表达量变化影响显著,且在黑腹果蝇不同发育阶段,相同基因mRNA的表达量差异显著。在胚胎时期rpr基因表达量受印楝素影响最大,幼虫期hid基因表达量受印楝素影响最大,在蛹期grim基因表达量受印楝素影响最大,成虫期三个基因表达量变化不明显。