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目的：体外建立骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)与牙髓细胞(Dental Pulp Cells, DPCs)的共培养体系,观察和评价两种细胞在共培养后各自细胞特性的变化和相互影响,探索最佳的两种细胞在共培养体系中的细胞比例和培养时间,体内评估该共培养体系培养后的细胞应用于牙髓再生中的可行性,为牙髓再生种子细胞的选择提供新思路及实验基础。方法：1、 体外分离、培养及鉴定BMMSCs和DPCs。将细胞在0.4 μm的Transwell小室中进行共培养,分组情况如下：①单一BMMSCs;②单一DPCs; ③BMMSCs和DPCs共培养组。共培养6天后,用MTT法绘制以上各组细胞的生长曲线并分别提取RNA及蛋白,分别进行聚合酶链反应(PCR)及蛋白免疫印迹(WB)检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)、基质细胞抗原-1(Stro-1)和CD145的表达情况。2、为探索最佳的共培养细胞比例和体外共培养时间,将细胞在0.4μm的Transwell小室中进行共培养,BMMSCs与DPCs按照10：I、I：I、1：5和1：10的比例分别共培养3、6、9、12天。提取以上各组细胞的mRNA,qPCR检测DSPP、ALP、Stro-1和CD146的表达并进行统计学分析。3、 将人牙牙根段的根管进行机械及化学预备,将牙根段随机分为4组,每组4个样本,将不同的细胞成分在水凝胶支架中混匀,并注入根管内,分组情况如下：①BMMSCs组；②DPCs组；③共培养组；④水凝胶支架空白组。将以上制备好的牙根段,移植到裸鼠背部,6周后取出标本,制作HE染色切片,并于显微镜下观察组织生长情况。结果：1、分离培养的SD大鼠骨髓间充质细胞,24小时后可见细胞贴壁呈比较均一的圆球状,3天后呈长梭形、纺锤样,随着培养时间延长,细胞增殖分裂聚集呈簇似漩涡样。流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物CD29,CD44表达阳性；造血干细胞标记物CD45,CD34表达阴性。用成骨诱导培养基、成脂诱导培养基及成软骨诱导培养基中诱导21天、21天和14天后,分别进行茜素红、油红0及阿尔新蓝染色阳性。牙髓细胞传至第三代后形态均一,长梭形,呈成纤维样细胞形态。免疫组织化学染色提示,角蛋白染色阴性,而波形丝蛋白染色阳性,提示培养的牙髓细胞为间充质来源,可用于后续实验。2、通过共培养体系,可以提高BMMSCs牙髓细胞特异标志物DSPP和ALP的表达,降低干细胞标志物Stro-1和CD146的表达,显示有向牙髓细胞向分化的趋势；同时也可以提高DPCs干细胞标志物的表达,降低牙髓细胞标志物的表达,提示有去分化的趋势,激活分化为其它细胞的潜能。3、共培养细胞比例与时间改变,会对共培养细胞的分化情况有明显影响。在BMMSCs与DPCs按照1：1与1：5的比例共培养时,可以较高效的诱导BMMSCs分化及DPCs表达干细胞特异标记物；体外共培养条件下,BMMSCs牙髓细胞标志物表达增加、干细胞标志物表达下降在共培养9-12天增加更为明显,DPCs干细胞标记物在共培养6-9天增加明显。4、BMMSCs与DPCs按照1：1比例共培养9天,并装配至多肽水凝胶支架充盈至经机械化学预备后的根管内,牙根段移植至裸鼠背部6周后,发现共培养组能再生组织结构与正常牙髓相似的类牙髓组织,而单一细胞组再生组织量较少且组织结构与正常牙髓差异较大。结论：1、在共培养体系中,BMMSCs与DPCs相互影响,增殖速率及mRNA、蛋白的表达发生变化；BMMSCs受DPCs的影响出现牙髓细胞向分化的趋势,DPCs出现去分化表现,结果提示共培养条件在一定程度可调控共培养细胞的增殖与分化,用低比例的DPCs获得更多来源的适合牙髓组织再生的种子细胞。2、在BMMSCs与DPCs共培养体系中,细胞共培养比例为1：1、1：5,体外共培养时间为9天左右时,细胞增殖与分化互相影响最为明显。3、体内皮下异位实验的结果显示,该共培养体系培养的细胞可以作为牙髓组织工程再生中的种子细胞使用。