论文部分内容阅读
仙台病毒(Sendaivirus，SeV)属于副粘病毒科副粘病毒属，是一个单股负链RNA病毒，小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠等啮齿类实验动物均易感。仙台病毒传染性强、易扩散，一般呈隐性感染，是啮齿类实验动物最难控制的病毒之一，鼠群感染仙台病毒后会改变体内细胞免疫反应，干扰试验结果，因此建立快速诊断方法十分必要。为了在实验动物微生物质量监控领域使诊断仙台病毒的检测更为特异、敏感、快速，本研究旨在利用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)构建出仙台病毒的检测方法，并通过初期临床实验验证了检测方法的可靠性，为仙台病毒在实验动物种群中的净化和控制提供相应的支持手段。
逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术检测仙台病毒的方法构建主要包括如下几个步骤:引物设计与筛选;体系优化;试剂配置;特异性、灵敏性及符合性实验。引物设计方面本研究从在NCBI下载仙台病毒(GI:9627219)全基因组，选择较为保守的融合蛋白(FusionProtein，FP)基因作为靶基因，与多种突变株FP基因进行比对，确定高度保守序列即靶序列，并设计出三套引物。并通过LAMP标准试剂盒筛选出最理想的一套;从病毒增殖液中提取病毒RNA作为模板，采用实时浊度仪对镁离子，dNTPs、Betaine、内外引物等影响因子的用量以及反应温度和反应时间做出了筛选，从而对整个体系进行了优化，并将根据优化结果装配了反应试剂;在体系灵敏性实验中，对病毒模板进行梯度倍比稀释后，SeVRT-LAMP最低可以检测到10-5梯度，最低检出限为0.95pg，是SeVRT-PCR检测灵敏度的30倍;在特异性实验中，SeVRT-LAMP仅检测出仙台病毒，并通过酶切反应证实其特异性扩增，其他如CDV等病原微生物的检出率为0;在符合性实验中，SeVRT-LAMP法检测结果与上海实验动物质量监督站采用ELISA方法检测的结果阳性符合率达到100％;
逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术检测仙台病毒的初步应用主要包括如下两个步骤:人工攻毒回归实验和临床应用。人工攻毒回归实验中，无论是血清样本还是肺组织样本，SeVRT-LAMP检测法的阳性检出率为100％;临床应用中，采用病毒分离、RT-PCR及RT-LAMP三种方法同时对50份待检样本进行仙台病毒检测。其中，病毒分离法检测出阳性8份，阳性感染率16％;RT-PCR检测出阳性9份，阳性感染率18％;RT-LAMP检测出阳性11份，阳性感染率22％。其中，病毒分离法检测为阳性的，RT-LAMP法检测均为阳性，RT-PCR检测出其中的7份;病毒分离为阴性的，RT-LAMP检测出其中3份为阳性;RT-PCR检测为阳性的，RT-LAMP法检测均为阳性;有两份样品仅有RT-LAMP法检测为阳性，SeVRT-LAMP与病毒分离法的阳性符合率为100％，SeVRT-PCR与病毒分离法的阳性符合率为87.5％，具体汇总在表。与上海实验动物质量监督检疫站的检测结果对照，RT-PCR与RT-LAMP有差异的2份样本中，有1份样本ELISA检测为可疑，1份样本检测为阳性。综合计算，SeVRT-LAMP与SeVRT-PCR的一致率为92％。值得一提的是，临床应用中的SeVRT-LAMP检测体系加入了钙黄绿素显色剂作为指示，反应结束后可直接用肉眼进行判断。
本研究所构建的SeVRT-LAMP检测方法快速灵敏，操作便捷、判定简单，为SeVRT-LAMP试剂盒的研制打下了良好的基础。如果设计出环引物，并优化钙黄绿素显色剂中锰离子与钙黄绿素的比例，可以进一步提升扩增效率，在临床应用中发挥更大的作用。总之，相比目前广泛使用的血清学检测法，SeVRT-LAMP作为核酸检测法，为仙台病毒在实验动物质量监控领域的早期检测、临床诊断、防控净化提供了一种新的选择。