基于杂交链反应的活细胞内端粒酶活性生物传感检测新方法研究

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与人体正常组织细胞相比,肿瘤细胞的端粒酶活性增强及其导致的细胞永生化与肿瘤发生发展密切相关。然而,传统的端粒酶活性检测方法——基于聚合酶链反应的端粒重复序列扩增法(TRAP),检测过程较为复杂,并且 Taq聚合酶活性容易被细胞提取物抑制。随着材料科学的发展,许多生物传感方法被用于细胞内端粒酶活性检测,但是也存在灵敏度和特异性较低的问题。针对上述存在的问题,本研究发展了一个基于杂交链反应(HCR)的细胞内端粒酶活性成像检测新方法,具体内容如下:  由端粒酶引物序列(HP)、HCR启动序列(trigger)组成DNA复合体(HPT),通过脂质体转染进入细胞浆。当端粒酶存在时,HPT可以被识别并延伸,产生大量trigger从而启动HCR放大反应,最后形成一个长链带缺口的双链DNA分子,缺口处伸出的单链能与报告基团复合体中的DNA单链Q杂交,释放出带有荧光基团的F链,并产生增强的荧光信号。在细胞裂解液中,通过凝胶电泳和荧光分析证明此方法切实可行,并且优化了一系列的反应条件。在最佳反应条件下分析细胞裂解产物中的端粒酶活性,其检测限为578个细胞/100μL。用脂质体装载纳米探针转染HeLa细胞,可以在细胞内观察到明显的荧光信号,而使用ASODN特异性抑制HeLa细胞内端粒酶活性后,再检测其活性,可以看到细胞内的荧光信号明显减弱,这表明此方法能灵敏、特异检测细胞内端粒酶活性。因此,通过检测和比较不同细胞中端粒酶活性,这一方法有望成为用于以端粒酶活性升高为特征的肿瘤细胞辅助诊断方法。
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