论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）是一种可以感染鸡、火鸡等禽类引起局部或全身感染的病原菌，其引起的禽大肠杆菌病给国内外家禽养殖业带来巨大的利益损失。长期以来，禽大肠杆菌病的防控主要依赖于抗菌药物，但抗菌药物长期、不科学的使用，导致APEC耐药性增强，且对动物源性食品安全构成威胁。噬菌体（bacteriophage）是一类感染细菌、真菌、支原体、蓝细菌和放线菌等微生物的细菌病毒的总称。烈性噬菌体的强裂解性和不易产生耐药性给禽大肠杆菌病的防治带来了新的契机。本研究从山东地区采集的大肠杆菌病发病鸡只肝脏病料或粪便、养殖场污水等样品中，分离、纯化出鸡源大肠杆菌及噬菌体。对分离的大肠杆菌致病性、毒力基因分布与噬菌体生物学特性及宿主谱进行了系统的研究，为鸡大肠杆菌病的防治及大肠杆菌噬菌体的临床应用提供了理论依据。
鸡源大肠杆菌的分离鉴定。采集山东省聊城、潍坊和烟台地区养鸡场病料、粪便及污水等500份样品，分别接种营养琼脂、麦康凯琼脂平板，37℃恒温培养，革兰氏染色镜检观察其形态学特征，生化试验观察其生化特性，并采用PCR方法对其进一步鉴定；了解本地区大肠杆菌的血清型分布特点，采用凝集试验对分离的大肠杆菌进行血清型的测定。共分离到364株鸡源大肠杆菌，经过形态学观察、生化鉴定及PCR鉴定，均符合大肠杆菌的特性；在364株鸡源大肠杆菌中，有251株可以确定其血清型，定型率为68.96%，其中优势血清型为O78（9.34%）、O1（7.42%）、O35（5.77%）、O2（4.67%）、O8（6.37%）、O15（4.40%）、O26（2.47%）、O76（2.20%）、O14（1.92%）、O127（1.92%）。
毒力基因分布及致病性试验。为了掌握本地区鸡源大肠杆菌毒力基因的分布情况，大肠杆菌的毒力基因与致病性之间的关系。对分离菌株进行了yijp、fimC等18种毒力基因的PCR检测；选取部分大肠杆菌进行鸡胚攻毒试验，以研究大肠杆菌的毒力基因与致病性之间的关系。对鸡源大肠杆菌常见的18种毒力基因进行鉴定，yijp、fimC、mat、ompA毒力基因检出率较高，未检测到neuC基因，其中携带5~9种毒力基因的大肠杆菌最为普遍，占总数的69.78%；鸡胚攻毒试验结果显示，携带毒力基因的数量与鸡胚的死亡率呈正相关。从病死鸡脏器中分离的大肠杆菌具有较高的致病性，具致病性的菌株中血清型O78的菌株致病性最强，其次为O2血清型菌株。同一血清型、携带不同毒力基因菌株的致病性存在较大差异。除O15外，其他血清型皆具有一定的致病性。
噬菌体的分离、鉴定及生物学特性研究。以分离的195株鸡源大肠杆菌为宿主菌，用双层平板法分离大肠杆菌的噬菌体，通过电子显微镜观察其形态，并进一步研究其温度稳定性、pH稳定性、最佳感染复数和一步生长曲线、最佳保存温度等生物学特性。分离鸡源大肠杆菌的噬菌体共155株，PLCF1噬菌体在电镜下呈现多面体立体结构，平面观察头部大致呈长六角形，长径约为120nm，横径约为120nm，无明显尾部结构。对两株形态差异较大的噬菌体进行生物学特性的研究，噬菌体效价可达109以上，在温度40℃以内可以保持较高的活性，最佳pH值为7，PLCF1最佳感染复数为0.001，PLCF72最佳感染复数为0.01，一步生长曲线可以看出PLCF1的裂解性能强于PLCF72；噬菌体的短期保存可以选择4℃、-20℃，长期保存则-80℃条件最为适宜。
噬菌体的宿主谱及覆盖率。对分离到的噬菌体用双层平板点滴法，测定噬菌体的宿主谱；通过对宿主谱的分析，选取噬菌体科学组合制成噬菌体混合制剂，用双层平板点滴法对实验室分离保存及不同地区采集的鸡源大肠杆菌覆盖率的进行筛查。83株大肠杆菌噬菌体对282株大肠杆菌菌株的宿主谱，裂解率可达78.01%，其中能裂解含宿主菌在内10株以上的噬菌体有49株，占所有噬菌体的59.04%。筛选组合宿主谱覆盖最广的10株噬菌体组成噬菌体的混合制剂Pmix，其对本实验室保存携带最多毒力基因的100株大肠杆菌的裂解率为62%，对全国各地不同地区随机采集100株大肠杆菌裂解率为41%。
鸡源大肠杆菌的分离鉴定。采集山东省聊城、潍坊和烟台地区养鸡场病料、粪便及污水等500份样品，分别接种营养琼脂、麦康凯琼脂平板，37℃恒温培养，革兰氏染色镜检观察其形态学特征，生化试验观察其生化特性，并采用PCR方法对其进一步鉴定；了解本地区大肠杆菌的血清型分布特点，采用凝集试验对分离的大肠杆菌进行血清型的测定。共分离到364株鸡源大肠杆菌，经过形态学观察、生化鉴定及PCR鉴定，均符合大肠杆菌的特性；在364株鸡源大肠杆菌中，有251株可以确定其血清型，定型率为68.96%，其中优势血清型为O78（9.34%）、O1（7.42%）、O35（5.77%）、O2（4.67%）、O8（6.37%）、O15（4.40%）、O26（2.47%）、O76（2.20%）、O14（1.92%）、O127（1.92%）。
毒力基因分布及致病性试验。为了掌握本地区鸡源大肠杆菌毒力基因的分布情况，大肠杆菌的毒力基因与致病性之间的关系。对分离菌株进行了yijp、fimC等18种毒力基因的PCR检测；选取部分大肠杆菌进行鸡胚攻毒试验，以研究大肠杆菌的毒力基因与致病性之间的关系。对鸡源大肠杆菌常见的18种毒力基因进行鉴定，yijp、fimC、mat、ompA毒力基因检出率较高，未检测到neuC基因，其中携带5~9种毒力基因的大肠杆菌最为普遍，占总数的69.78%；鸡胚攻毒试验结果显示，携带毒力基因的数量与鸡胚的死亡率呈正相关。从病死鸡脏器中分离的大肠杆菌具有较高的致病性，具致病性的菌株中血清型O78的菌株致病性最强，其次为O2血清型菌株。同一血清型、携带不同毒力基因菌株的致病性存在较大差异。除O15外，其他血清型皆具有一定的致病性。
噬菌体的分离、鉴定及生物学特性研究。以分离的195株鸡源大肠杆菌为宿主菌，用双层平板法分离大肠杆菌的噬菌体，通过电子显微镜观察其形态，并进一步研究其温度稳定性、pH稳定性、最佳感染复数和一步生长曲线、最佳保存温度等生物学特性。分离鸡源大肠杆菌的噬菌体共155株，PLCF1噬菌体在电镜下呈现多面体立体结构，平面观察头部大致呈长六角形，长径约为120nm，横径约为120nm，无明显尾部结构。对两株形态差异较大的噬菌体进行生物学特性的研究，噬菌体效价可达109以上，在温度40℃以内可以保持较高的活性，最佳pH值为7，PLCF1最佳感染复数为0.001，PLCF72最佳感染复数为0.01，一步生长曲线可以看出PLCF1的裂解性能强于PLCF72；噬菌体的短期保存可以选择4℃、-20℃，长期保存则-80℃条件最为适宜。
噬菌体的宿主谱及覆盖率。对分离到的噬菌体用双层平板点滴法，测定噬菌体的宿主谱；通过对宿主谱的分析，选取噬菌体科学组合制成噬菌体混合制剂，用双层平板点滴法对实验室分离保存及不同地区采集的鸡源大肠杆菌覆盖率的进行筛查。83株大肠杆菌噬菌体对282株大肠杆菌菌株的宿主谱，裂解率可达78.01%，其中能裂解含宿主菌在内10株以上的噬菌体有49株，占所有噬菌体的59.04%。筛选组合宿主谱覆盖最广的10株噬菌体组成噬菌体的混合制剂Pmix，其对本实验室保存携带最多毒力基因的100株大肠杆菌的裂解率为62%，对全国各地不同地区随机采集100株大肠杆菌裂解率为41%。