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眼睛是人和动物重要的感觉器官，它从外向内由角膜、虹膜、晶状体、视网膜、色素上皮及脉络膜等主要眼组织构成，其精密结构与复杂的协调机制保证了光-电信号的迅速转换和电信号传递至大脑产生视觉的过程。由于眼睛结构精密且组织较难再生，眼部疾病往往会导致视力产生不可逆的损伤。目前世界最主要的致盲眼疾有白内障和年龄相关性黄斑变性等，白内障主要表现为晶状体浑浊和由此引起的视力下降，基因突变、老龄、环境应激因子如紫外线以及人类其它疾病综合症如糖尿病等因素对晶体上皮细胞(LEC)的不良刺激是白内障的主要诱因。年龄相关性黄斑变性(AMD)是另一类严重致盲眼病，其中占比超过80%的干性AMD主要病理特征为视网膜色素上皮(RPE)在氧化应激导致损伤后产生细胞凋亡，导致RPE的结构及其支持视网膜感光细胞代谢的功能被破坏。因此，白内障和干性AMD的形成与环境应激因子，如氧化应激导致的LEC或RPE细胞DNA损伤及相关蛋白的功能改变密切相关。而研究表明，蛋白质SUMO化修饰能对响应这些应激的关键蛋白功能产生调控作用。
蛋白质SUMO(Protein SUMOylation)化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。SUMO基因表达SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)前体蛋白，通过在SENP(Sentrin/SUMO Specific Proteases)蛋白水解酶作用加工成成熟SUMO小分子蛋白。在ATP供能驱动下，SUMO蛋白被激活并连接到SUMO化激活酶E1上，随后被转至与E2结合酶Ubc9连接；E3连接酶在识别靶蛋白SUMO化序列后，通过其RING结构将靶蛋白拉近Ubc9-SUMO复合物，催化SUMO蛋白C末端甘氨酸与靶蛋白SUMO化序列的赖氨酸形成异构肽键，完成对靶蛋白的SUMO化修饰。靶蛋白-SUMO复合物又能在SENP蛋白发挥异构肽酶的作用下断裂该异构肽键，这个过程即为蛋白质去SUMO化，它与蛋白质SUMO化一起构成了完整的SUMO化修饰。
自SUMO化被发现以来，已有的研究表明SUMO化修饰对DNA合成、DNA损伤修复、基因转录、蛋白质合成有调控作用，并参与了细胞分裂、自噬、转化、衰老和凋亡等一系列生理活动。本实验室眼睛发育和病理相关的SUMO化研究证明，SUMO化通过调控一系列转录因子如Pax6和Sp1的功能，来控制晶状体的分化。对AMD病理调控机制的研究表明，去SUMO化的p53将异染色质募集在促凋亡基因启动子区域并抑制其表达，是视网膜色素上皮在氧化应激刺激下产生保护作用的重要机制。
虽然在眼睛发育与病理相关研究领域已有上述SUMO化修饰研究工作发表，但我们对SUMO化在眼睛发育和重大眼疾中的功能，尤其是去SUMO化酶SENP发挥的功能了解甚少。因此，本毕业论文选择在前述工作的基础上，进一步确定蛋白质去SUMO化酶在正常眼睛主要组织中的表达模式，并深入探讨在环境应激因子诱导的白内障以及AMD小鼠模型中去SUMO化酶表达模式的改变，同时分析了晶体上皮细胞中，SUMO化修饰对Bid发挥其促凋亡功能的影响，以帮助更全面了解SUMO化在上述眼疾病理发生中的作用。
为了开展以上研究，我通过q-RTPCR和WesternBlot技术，对正常小鼠角膜、晶体上皮细胞、晶体纤维细胞和视网膜等主要眼组织的去SUMO化酶SENP表达进行了分析。结果表明，所有SENPmRNA在视网膜中的表达水平较高，它们分别是角膜中7种SENPmRNA的3.5-7.5倍，是晶状体上皮细胞中7种SENPmRNA的3-10.5倍，以及晶状体纤维细胞中7种SENPmRNA的4-12倍；同时，不同SENP蛋白在不同眼组织出现明显的组织特异性，SENP5、SENP6和SENP7蛋白表达水平在视网膜中最高，它们分别是角膜中相应SENP蛋白的6.3、1.4和n倍(n表明角膜中不表达SENP7蛋白,下同)，晶状体上皮细胞中相应SENP蛋白的n倍、1.7倍和1.2倍，以及晶状体纤维细胞相应SENP蛋白的11.6倍、4.4倍和2.1倍。而SENP1-3蛋白在角膜中表达水平最高，它们分别是视网膜中相应SENP蛋白的2.1倍、11倍和1.6倍，晶状体上皮细胞中相应SENP蛋白的3.7倍、10.5倍和1.1倍，晶状体纤维细胞中相应SENP蛋白的3.7、n和n倍。SENP8蛋白主要存在于角膜中，而视网膜和晶状体中几乎检测不到。上述结果表明，七种SENP酶在4种正常眼组织中，出现明显的表达差异。
随后，我建立了紫外线(UVA)和氧化应激(葡萄糖氧化酶，GlucoseOxidase，GO)诱导的体外白内障模型，并检测了晶体上皮中的7种SENP的mRNA和蛋白表达水平变化。结果表明，在UVA诱导模型中，所有SENPmRNA的水平都出现上调。相对正常晶状体上皮细胞而言，SENP1-3，5-8分别上调了1、2、3、0.6、1.6、0.2和2.3倍。而在蛋白水平，除SENP7有10%的上调外，SENP1-3，5-6和8都是下调的，分别下调了35%、40%、15%、50%、52%和20%。在葡萄糖氧化酶(GO)诱导的体外白内障小鼠模型中，7种SENP酶的mRNA表达水平全部下降。这一结果与在UVA诱导的模型中SENPmRNA的上调形成鲜明的对比。GO诱导导致SENP1-3，5-8mRNA表达水平分别下降了65%、70%、70%、50%、70%、60%和85%。在蛋白水平，GO诱导上调了SENP1(10%)、SENP2(30%)和SENP6(35%)，但显著下调了SENP5(65%)和SENP8(60%)，GO诱导并不改变SENP3和SENP7的蛋白水平。这些结果表明，应激因子UVA和过氧化氢对SENP酶有不同的调控机制。
再次，我通过对小鼠腹腔进行碘酸钠注射，建立了老年性黄斑变性的小鼠AMD模型，并在注射后3天内通过q-RTPCR和westernblot分析了视网膜和RPE中7种SENP酶的mRNA和蛋白质的表达模式的变化。结果表明，在注射后第一天的视网膜和RPE中，碘酸钠诱导导致SENP1-3，5和8mRNA分别下调了20%、20%、30%、25%和10%，相同条件下SENP6和SENP7mRNA相对稳定；在注射后的第二天视网膜和RPE中，除SENP1、SENP5和SENP6mRNA分别上调了10%、10%和30%以外，其它SENP酶的mRNA在诱导组和对照组基本相同；而在注射后的第三天视网膜和RPE中，所有SENP酶的mRNA全部下调，分别下降了23%、25%、30%、20%、18%、22%和35%。在蛋白水平，注射后第一天，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞上调SENP1(15%)和SENP5(25%)；下调SENP2(20%)，SENP6(30%)和SENP8(10%)，而SENP3和SENP7则保持不变。注射后第二天，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞下调SENP1-2和SENP6-8，分别下调了40%、15%、10%、38%和25%；与此同时，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞上调SENP3(10%)和SENP5(10%)；而在注射后第三天的视网膜和RPE中，碘酸钠诱导4种SENP酶上调，分别是SENP1(5%)、SENP3(10%)、SENP5(10%)和SENP6(40%)；此外，SENP2、SENP7和SENP8则分别下调了20%、15%和20%。
最后，通过生物信息分析、体外SUMO化、免疫共沉淀和体外突变等方法，我分析了关联内、外凋亡途径的重要促凋亡因子Bid的SUMO化，初步结果表明Bid在K123，K129，K135和K157四个位点都可能被SUMO化，从而与泛素化进行竞争，增加其稳定性和促凋亡功能。
这些结果表明晶体上皮细胞和视网膜等组织中SENP酶的表达在不同应激因子的作用下，出现明显差异。而这些表达差异很可能通过调节SUMO化修饰细胞凋亡相关蛋白如Bid，其凋亡相关功能，参与白内障及AMD病理发生和进程。
本论文通过现代分子生物学研究方法，首次阐明了7种去SUMO化蛋白酶在4种小鼠主要眼组织中的不同表达模式。在此基础上，我建立了两种体外白内障模型和年龄相关性黄斑变性小鼠模型，并进一步分析了这些模式动物中晶体上皮细胞和视网膜中7种SENP蛋白酶表达模式的改变，初步分析了底物蛋白Bid的SUMO化。这些结果为深入研究去SUMO化在维持正常眼组织生理功能，以及调控重大眼疾的病理进程中的作用奠定了必要的基础。
蛋白质SUMO(Protein SUMOylation)化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰。SUMO基因表达SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)前体蛋白，通过在SENP(Sentrin/SUMO Specific Proteases)蛋白水解酶作用加工成成熟SUMO小分子蛋白。在ATP供能驱动下，SUMO蛋白被激活并连接到SUMO化激活酶E1上，随后被转至与E2结合酶Ubc9连接；E3连接酶在识别靶蛋白SUMO化序列后，通过其RING结构将靶蛋白拉近Ubc9-SUMO复合物，催化SUMO蛋白C末端甘氨酸与靶蛋白SUMO化序列的赖氨酸形成异构肽键，完成对靶蛋白的SUMO化修饰。靶蛋白-SUMO复合物又能在SENP蛋白发挥异构肽酶的作用下断裂该异构肽键，这个过程即为蛋白质去SUMO化，它与蛋白质SUMO化一起构成了完整的SUMO化修饰。
自SUMO化被发现以来，已有的研究表明SUMO化修饰对DNA合成、DNA损伤修复、基因转录、蛋白质合成有调控作用，并参与了细胞分裂、自噬、转化、衰老和凋亡等一系列生理活动。本实验室眼睛发育和病理相关的SUMO化研究证明，SUMO化通过调控一系列转录因子如Pax6和Sp1的功能，来控制晶状体的分化。对AMD病理调控机制的研究表明，去SUMO化的p53将异染色质募集在促凋亡基因启动子区域并抑制其表达，是视网膜色素上皮在氧化应激刺激下产生保护作用的重要机制。
虽然在眼睛发育与病理相关研究领域已有上述SUMO化修饰研究工作发表，但我们对SUMO化在眼睛发育和重大眼疾中的功能，尤其是去SUMO化酶SENP发挥的功能了解甚少。因此，本毕业论文选择在前述工作的基础上，进一步确定蛋白质去SUMO化酶在正常眼睛主要组织中的表达模式，并深入探讨在环境应激因子诱导的白内障以及AMD小鼠模型中去SUMO化酶表达模式的改变，同时分析了晶体上皮细胞中，SUMO化修饰对Bid发挥其促凋亡功能的影响，以帮助更全面了解SUMO化在上述眼疾病理发生中的作用。
为了开展以上研究，我通过q-RTPCR和WesternBlot技术，对正常小鼠角膜、晶体上皮细胞、晶体纤维细胞和视网膜等主要眼组织的去SUMO化酶SENP表达进行了分析。结果表明，所有SENPmRNA在视网膜中的表达水平较高，它们分别是角膜中7种SENPmRNA的3.5-7.5倍，是晶状体上皮细胞中7种SENPmRNA的3-10.5倍，以及晶状体纤维细胞中7种SENPmRNA的4-12倍；同时，不同SENP蛋白在不同眼组织出现明显的组织特异性，SENP5、SENP6和SENP7蛋白表达水平在视网膜中最高，它们分别是角膜中相应SENP蛋白的6.3、1.4和n倍(n表明角膜中不表达SENP7蛋白,下同)，晶状体上皮细胞中相应SENP蛋白的n倍、1.7倍和1.2倍，以及晶状体纤维细胞相应SENP蛋白的11.6倍、4.4倍和2.1倍。而SENP1-3蛋白在角膜中表达水平最高，它们分别是视网膜中相应SENP蛋白的2.1倍、11倍和1.6倍，晶状体上皮细胞中相应SENP蛋白的3.7倍、10.5倍和1.1倍，晶状体纤维细胞中相应SENP蛋白的3.7、n和n倍。SENP8蛋白主要存在于角膜中，而视网膜和晶状体中几乎检测不到。上述结果表明，七种SENP酶在4种正常眼组织中，出现明显的表达差异。
随后，我建立了紫外线(UVA)和氧化应激(葡萄糖氧化酶，GlucoseOxidase，GO)诱导的体外白内障模型，并检测了晶体上皮中的7种SENP的mRNA和蛋白表达水平变化。结果表明，在UVA诱导模型中，所有SENPmRNA的水平都出现上调。相对正常晶状体上皮细胞而言，SENP1-3，5-8分别上调了1、2、3、0.6、1.6、0.2和2.3倍。而在蛋白水平，除SENP7有10%的上调外，SENP1-3，5-6和8都是下调的，分别下调了35%、40%、15%、50%、52%和20%。在葡萄糖氧化酶(GO)诱导的体外白内障小鼠模型中，7种SENP酶的mRNA表达水平全部下降。这一结果与在UVA诱导的模型中SENPmRNA的上调形成鲜明的对比。GO诱导导致SENP1-3，5-8mRNA表达水平分别下降了65%、70%、70%、50%、70%、60%和85%。在蛋白水平，GO诱导上调了SENP1(10%)、SENP2(30%)和SENP6(35%)，但显著下调了SENP5(65%)和SENP8(60%)，GO诱导并不改变SENP3和SENP7的蛋白水平。这些结果表明，应激因子UVA和过氧化氢对SENP酶有不同的调控机制。
再次，我通过对小鼠腹腔进行碘酸钠注射，建立了老年性黄斑变性的小鼠AMD模型，并在注射后3天内通过q-RTPCR和westernblot分析了视网膜和RPE中7种SENP酶的mRNA和蛋白质的表达模式的变化。结果表明，在注射后第一天的视网膜和RPE中，碘酸钠诱导导致SENP1-3，5和8mRNA分别下调了20%、20%、30%、25%和10%，相同条件下SENP6和SENP7mRNA相对稳定；在注射后的第二天视网膜和RPE中，除SENP1、SENP5和SENP6mRNA分别上调了10%、10%和30%以外，其它SENP酶的mRNA在诱导组和对照组基本相同；而在注射后的第三天视网膜和RPE中，所有SENP酶的mRNA全部下调，分别下降了23%、25%、30%、20%、18%、22%和35%。在蛋白水平，注射后第一天，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞上调SENP1(15%)和SENP5(25%)；下调SENP2(20%)，SENP6(30%)和SENP8(10%)，而SENP3和SENP7则保持不变。注射后第二天，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞下调SENP1-2和SENP6-8，分别下调了40%、15%、10%、38%和25%；与此同时，碘酸钠诱导视网膜和色素上皮细胞上调SENP3(10%)和SENP5(10%)；而在注射后第三天的视网膜和RPE中，碘酸钠诱导4种SENP酶上调，分别是SENP1(5%)、SENP3(10%)、SENP5(10%)和SENP6(40%)；此外，SENP2、SENP7和SENP8则分别下调了20%、15%和20%。
最后，通过生物信息分析、体外SUMO化、免疫共沉淀和体外突变等方法，我分析了关联内、外凋亡途径的重要促凋亡因子Bid的SUMO化，初步结果表明Bid在K123，K129，K135和K157四个位点都可能被SUMO化，从而与泛素化进行竞争，增加其稳定性和促凋亡功能。
这些结果表明晶体上皮细胞和视网膜等组织中SENP酶的表达在不同应激因子的作用下，出现明显差异。而这些表达差异很可能通过调节SUMO化修饰细胞凋亡相关蛋白如Bid，其凋亡相关功能，参与白内障及AMD病理发生和进程。
本论文通过现代分子生物学研究方法，首次阐明了7种去SUMO化蛋白酶在4种小鼠主要眼组织中的不同表达模式。在此基础上，我建立了两种体外白内障模型和年龄相关性黄斑变性小鼠模型，并进一步分析了这些模式动物中晶体上皮细胞和视网膜中7种SENP蛋白酶表达模式的改变，初步分析了底物蛋白Bid的SUMO化。这些结果为深入研究去SUMO化在维持正常眼组织生理功能，以及调控重大眼疾的病理进程中的作用奠定了必要的基础。