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植物的类病变突变体可在没有明显的逆境、损伤或病原物侵染的条件下,在叶片上自主地形成类似于病原物侵染形成的坏死斑。这类突变体是研究植物程序化细胞死亡的极好材料。本研究涉及的水稻类病变突变体lmi((l)esion(m)imic_initiation)是在水稻大田中发现的一个自发突变。
lmi突变体的植株在生长三叶期时,其叶片上开始出现类病变坏死的斑点。用台盼蓝染色和自发荧光染色可以观察到突变体上的细胞坏死以散发的状态存在。光照处理实验表明该突变体的类病变坏死斑的发生程度受光照强度的影响。在透射电镜下,与野生型的叶绿体相比,突变体细胞的叶绿体形态不规则,内部结构着色深,无明显的片层结构。
遗传分析表明,该突变性状由一个隐性单基因控制。通过分子标记连锁分析和精细定位我们鉴定和分离了LMI的候选基因。lmi突变体的功能互补实验表明该基因就是控制水稻发生自发起始性类病变病斑的LMI基因,因为包含野生型LMI基因的基因组DNA片段能完全恢复lmi突变体的表型。值得注意的是,与不同品种的野生型水稻的LMI基因的DNA序列相比,lmi的基因序列并没有特异性的改变,但在启动子区域的甲基化程度上,lmi明显地低于LMI。LMI基因的ORF序列为1350bp,编码一个天冬氨酸蛋白酶。LMI与拟南芥的CDR1、烟草的CND41、大麦的Nucellin蛋白同属于天冬氨酸蛋白酶家族,而这些已知蛋白的功能都与细胞调亡、植物衰老或抗病有一定的相关性。LMI:GFP融合蛋白的亚细胞定位结果显示LMI蛋白定位在细胞核中。
RT-PCR结果显示LMI基因主要在水稻的幼穗中表达,但在lmi突变体的含有病斑的叶片中,LMI的表达量相对于同时期的野生型叶片有显著的提高；而且,过表达LMI的基因植株也表现出与突变体相类似的性状。这些结果都说明突变体中该基因表达量的变化可能是造成突变表型的因为。虽然lmi突变体的类病变坏死斑的发生及其严重程度受光照及光照强度的影响,但LMI基因的表达却不受光照的影响。
在lmi突变体中,对部分与抗逆反应和细胞凋亡相关的marker基因的表达分析表明一些PR基因,如PR-1,PR-10和APO(apoptosis related gene),受LMI的调控。在拟南芥中,过量光能的吸收需要LSD1的功能(Mateo,Muhlenbock et al.2004),水稻中的OsLSD1是LSD1的同源基因。有研究表明在水稻的OsLSD1反义转基因植株中出现的叶片坏死也受到光的影响(Wang,Pei et al.2005)。值得注意的是,在lmi突变体的叶片中,OsLSD1的表达也明显受抑；反之,在OsLSD1的反义转基因植株中,LMI的表达则未受影响。据此推测,LMI可能处于OsLSD1参与的信号传递途径的上游,通过调控OsLSD1的表达来行使功能。