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角膜上皮细胞不断受到外界物理、化学以及生物因素的侵袭,形成损伤,失去正常的屏障功能。角膜上皮损伤修复是否成功直接关系到能否保持正常视力。角膜损伤修复涉及多个相互联系的过程:细胞迁移、增殖、细胞.胞外基质黏附以及组织重构。角膜损伤修复受到生长因子的正向调控以及环境中的不利因素(如紫外线、渗透压改变以及缺氧)的负向调控。本研究将考察上皮生长因子(EGF)和缺氧如何调控角膜上皮损伤修复。结果证实蛋白质翻译后修饰(乙酰化修饰和类泛素化修饰)在EGF和缺氧调控角膜上皮细胞功能中发挥重要作用。
本研究分为三部分:
第一部分:EGF促进角膜上皮细胞损伤修复的机制研究:HDAC6介导的蛋白质去乙酰化修饰的作用。目的:考察HDAC6介导的去乙酰化活性对于角膜上皮损伤修复的作用。方法:细胞免疫荧光考察HDAC6分子的定位变化；去乙酰化酶活性检测试剂盒以及检测细胞乙酰化α-tubulin水平考察HDAC6的活性；建立角膜损伤修复模型:细胞模型一划痕实验；动物模型一小鼠眼球角膜磨损实验。结果:EGF通过改变HDAC6的定位以及增强其活性,减少乙酰化α-tubulin,促进角膜上皮细胞损伤修复；去乙酰化酶抑制剂TSA在细胞模型和动物模型中均能够抑制角膜上皮损伤修复进程；沉默HDAC6基因能抑制角膜上皮细胞的损伤修复。结论:角膜上皮细胞损伤修复过程需要HDAC6介导的去乙酰化修饰效应；EGF通过刺激HDAC6移位以及增强HDAC6活性,促进角膜上皮细胞损伤修复。
第二部分:缺氧降低角膜上皮细胞损伤修复的机制研究。目的:初步探究缺氧抑制角膜上皮细胞损伤修复的机制。方法:缺氧条件:1％氧气处理1-4小时；MTT方法检测细胞总体生存率；Western Blot检测剪切型Caspase3考察细胞凋亡状态；Real-time PCR.检测mRNA量。结果:缺氧减慢角膜上皮细胞损伤愈合速度；缺氧降低角膜上皮细胞总体生存率；缺氧提高HDAC6活性；过表达CTCF逆转缺氧诱导的Caspase3的剪切；沉默CTCF基因增加缺氧诱导的细胞死亡；缺氧下降CTCF的mRNA量,但不降低蛋白量；缺氧去除CTCF的一种蛋白质翻译后修饰。结论:缺氧通过抑制CTCF基因表达、通过改变CTCF翻译后修饰来影响角膜上皮细胞生死,调节损伤修复进程。
第三部分:缺氧诱导CTCF去类泛素化(SUMO)修饰的机制和功能研究。目的:确定对缺氧敏感的CTCF修饰的性质；考察CTCF SUMO化修饰对于下游靶基因pax6的作用；考察缺氧条件下CTCF去SUMO化修饰的机制。方法:免疫共沉淀方法确定CTCF修饰条带性质；突变CTCF的SUMO化修饰位点,利用荧光素酶报告基因方法比较野生型和突变型CTCF对于pax6启动子活性的影响。结果:缺氧诱导CTCF去除SUMO化修饰；突变CTCF上SUMO化修饰位点反而增强其对于pax6启动子的抑制作用；过表达SENP1能减少CTCF SLIMO化修饰,抑制Pax6表达；缺氧降低Pax6表达；过表达SUMO2部分恢复缺氧条件下CTCF的SUMO化修饰。结论:缺氧诱导CTCF去除SUMO化修饰,进一步抑制Pax6基因表达。
本研究的新颖之处:
1,第一次证明HDAC6在角膜上皮细胞损伤修复中的作用；
2,提出EGF调控HDAC6的新机制即EGF增强HDAC6的酶活性；
3,第一次证明缺氧下调CTCF基因表达,促使细胞死亡。
4,首次发现缺氧能去除CTCF SUMO化修饰；
5,证明CTCF的SUMO化修饰如何影响pax6启动子活性。