黑曲霉产糖化酶合成培养基优化及代谢轮廓分析方法的初步探究

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糖化酶是世界上产量最大的酶之一,平均产量达到20g/L,但依旧供不应求。糖化酶的合成与菌体代谢密切相关,为了进一步了解糖化酶合成的限制性瓶颈,本文采用代谢流和代谢轮廓分析的手段对黑曲霉产糖化酶的过程进行了深入的研究。  鉴于代谢流和代谢轮廓分析需要在全合成培养基下进行,本文构建了全合成培养基,考察了无机氮源种类、碳氮比、磷源对糖化酶活性的影响,并对金属离子进行优化,得到了预测的最优化条件。  对胞内代谢物的检测,本文建立了基于气相色谱,质谱连用的黑曲霉代谢轮廓分析的研究方法。考察了不同的衍生剂和溶解剂对标准品响应度的影响。同时以黑曲霉为对象,研究了不同的淬灭剂和提取液对黑曲霉胞内代谢物的影响,考察了淬灭剂的淬灭效果。并对建立的方法进行了科学的验证,结果表明该方法具有良好的生物选择性、精确度、稳定性和重复性。所建立的方法为后续的黑曲霉代谢物轮廓分析打下了很好的基础。  通过代谢流和代谢轮廓分析方法系统地研究了两株黑曲霉菌株宏观及微观代谢的差异。宏观的差异主要表现为突变株的底物和氧气消耗速率与野生株相近,但是糖化酶的酶活却达到了野生株的7.88倍,而副产物的浓度仅为野生株的十分之一。对胞内代谢物进行主成分分析,确定了4种胞内代谢水平的生物标志物。通过胞内代谢通量分析,发现突变株在氧化磷酸化、磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway)、氨基酸合成途径上均有不同程度的加强,底物利用率较野生菌株提高了近30%。以上研究结果很好地解释了黑曲霉响应糖化酶合成的代谢规律,它为黑曲霉菌株的菌种改造设计和发酵过程的优化提供了新的思路。
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