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近年来,很多证据表明Th1和Th2细胞在介导机体免疫应答中具有重要作用。Th1/Th2通过分泌的细胞因子进行自我和相互调节,维持二者的免疫平衡,这一特性与中医理论的阴阳学说极为相似。Th1/Th2的平衡作为免疫平衡的核心,对免疫系统的稳定起着重要调节作用。Th1分泌的LFN-γ与Th2分泌的IL-4之间的平衡对Th1/Th2起关键调控作用。在实际研究中,一般以高表达的IFN-γ和IL-4分别代表Th1和Th2。
在兽医临床中发现,由黄柏、苍术、藿香、石膏以不同比例组成的中药复方Ⅰ和中药复方Ⅱ,可提高猪对高热环境的适应能力。为探讨黄柏生物碱及其复方对热应激的调控机制,本文研究了高温应激条件下猪和小鼠免疫相关指标lFN-γ、IL-4的变化规律以及黄柏生物碱及其复方的免疫调节作用。完成的实验有:
采用ELISA法,研究中药复方对热应激后猪血清、脾脏中IFN-γ、IL-4水平的调控作用。热应激可使IFN-γ、IL-4水平显著上升,中药复方Ⅰ和中药复方Ⅱ均可显著调节热应激时IFN-γlL-4水平的升高,使其恢复到正常,且中药复方Ⅱ的效果更好。进一步研究中约复方Ⅱ显示,中药复方Ⅱ可有效调节热应激所致的小鼠脾脏中IFN-γIL-4的改变,使其恢复至正常。
为评价复方中黄柏活性部位的药理作用,建立了小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的热应激模型。热应激模型条件为:热应激温度40℃、热应激时间1h、热应激后3h采样测定。
对黄柏生物碱的提取和纯化进行了优选。采用比色法筛选碱提、醇提、酸提、酸醇提四种黄柏提取方法,醇提法的效果最好;采用正交设计法优化黄柏醇提法的提取工艺,提取工艺为:生药10倍量的75%乙醇回流提取3次,每次1.5h;采用大孔树脂吸附法和盐析法筛选黄柏纯化工艺,前者效果较好且以30%的乙醇作为洗脱剂,所得生物碱的含量最高。
采用MTT法,筛选黄柏生物碱的活性部位,高温可显著抑制小鼠脾脏淋巴细胞的增殖。碱提、醇提、酸醇提、酸提黄柏生物碱(100μg/ML)均可显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖。用大孔吸附树脂纯化醇提的黄柏生物碱进行药效学筛选,结果显示100μg/mL的黄柏生物碱对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的促进作用最强。为进一步验证MTT法筛选出的黄柏生物碱活性部位对热应激的免疫调控作用,采用ELISA法测定了体外培养小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ、IL-4的含量,小鼠脾脏淋巴细胞在热应激条件下IFN-γ、IL-4水平偏离正常,纯化黄柏生物碱可使其迅速恢复止常。
以上试验表明,黄柏生物碱及其中药复方均可显著调节热应激对机体免疫机能所致的改变,维持机体在高温下的稳态。