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研究目的:
根据我国居民日常饮食中常见的两种硫的衍生物(SulfuricDerivatives，SD)——硫代硫酸钠(SodiumThiosulfate，STS)和亚硫酸氢钠(SodiumBisulfite，SOB)，利用模式动物斑马鱼对这两种化学物质是否存在致畸效应进行系统评价，并对其致畸作用的分子基础进行初步研究，为我国孕妇硫的衍生物发育暴露危险度评价工作的开展，降低因食品含硫化合物导致的生育风险提供基础。
研究方法:
1.采用不同浓度的硫代硫酸钠和亚硫酸氢钠进行斑马鱼胚胎暴露处理，观测斑马鱼的心率、循环等指标，计算发育畸形指数(developmentalmalformationindex，DMI)；通过整体胚胎免疫染色，分别检测STS或SOB暴露后胚胎的运动神经元功能，神经元的增殖状态及胚胎的细胞凋亡情况；WesternBlot检测α-Tubulin、PCNA、Bcl—2和Bax的蛋白表达水平。
2.采用原位杂交技术，检测斑马鱼胚胎暴露于STS或SOB后miRNAs的表达水平，初步确定STS和SOB致畸作用的候选靶miRNAs。
3.通过显微注射技术对候选靶miRNA进行过表达和敲低的实验，观测斑马鱼的发育畸形效应，以及运动神经元功能和神经元的增殖状态，初步对候选靶miRNAs进行功能鉴定。
结果:
1.1×10-7mol/LSOB处理组表现出多系统的发育畸形，24小时(hourspostfertilization，hpf)的胚胎，与对照组相比体长略有增加、肠区出现明显水肿，在48hpf和96hpf则出现明显的畸形。
2.1×10-1～1mol/LSTS暴露处理的胚胎有严重的发育迟滞，多器官发育畸形，血流缓慢和局限性出血；1×10-4mol/L～1×10-2mol/LSTS暴露处理表现出心血管系统和神经系统的发育畸形。在胚胎暴露处理至24hpf时，观察体轴和器官与对照组相比无明显差异，而在48hpf和96hpf则出现明显的畸形。
3.计算斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率，结果发现在受精后SOB或STS暴露的斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率随暴露时间的增长和暴露剂量的增加而增加。
4.α-Tubulin、PCNA、Bcl—2和Bax整体胚胎免疫染色和免疫印迹结果显示：SOB处理组在胚胎发育至24hpf时α-Tubulin蛋白和PCNA蛋白表达比对照组均显著降低；48hpf时α-Tubulin蛋白表达显著降低，PCNA蛋白表达降低并有定位改变；96hpfα-Tubulin蛋白表达显著降低且有定位改变，PCNA蛋白表达显著降低；Bcl—2蛋白表达显著降低，并有定位改变；Bax蛋白表达显著降低。STS处理组在胚胎发育至48hpf时α-Tubulin蛋白表达比对照组显著降低；PCNA蛋白表达在胚胎发育至48hpf时显著增高，有表达定位改变；而在发育至96hpf时，α-Tubulin和PCNA蛋白表达显著降低且均有表达定位改变；Bcl—2蛋白表达显著降低，并有定位改变；Bax蛋白表达显著降低并有定位改变。
5.利用LNA修饰的miRNAs探针行胚胎整体原位杂交显示，当斑马鱼胚胎神经系统和软骨骨骼组织暴露于1×10-3mol/LSTS中，可诱导miR—124表达降低，而心肌组织中miR—133a和miR—1表达与对照组无明显差异；暴露于1×10-7mol/LSOB中，可诱导miR—124表达降低，但不如1×10-3mol/LSTS的作用显著，心肌组织中miR—133a表达降低而miR—1表达增加。
6.通过显微注射对候选靶miR—124进行过表达，发现在24hpf斑马鱼出现体短、尾卷曲以及头部分化异常等畸形，而敲低miR—124则无明显异常；对另一miRNAmiR—125进行过表达，发现在48hpf斑马鱼出现尾部椎管膨大畸形，而小剂量敲低miR—125则无明显异常。同时过表达miR—124和miR—125，发现在24hpf斑马鱼胚胎出现了小头、体短、软骨发育不良、心包扩大，在过表达miR—124和miR—125后敲低miR—124水平，发现胚胎除有体短、心包扩大外，还出现尾部向躯体一侧卷折。
结论:
1.STS和SOB对斑马鱼胚胎发育具有致畸作用和剂量依赖效应，其中斑马鱼胚胎在高剂量暴露时主要表现为胚胎死亡，而低剂量暴露时则主要表现为胚胎发育畸形；STS低剂量暴露主要影响胚胎发育后期的神经系统、心血管系统及颌面部形态发生与分化，SOB低剂量暴露主要影响胚胎发育早期神经系统、心血管系统、颌面部及肠区的形态发生与分化，由此推测，硫的衍生物在体内的代谢残留物可能通过抑制细胞周期影响神经细胞的增殖分化。
2.神经系统miRNAs表达降低是硫的衍生物诱发斑马鱼胚胎畸形过程中的一个重要分子事件，而miRNAs与其靶基因或对其靶基因上游区之间的相互作用可能是其致畸的一种分子机制。
3.miR—124过表达产生的斑马鱼胚胎腹侧脊髓分化异常以及后脑分化异常，可能与异位表达miR—124有关。
4.miR—125过表达产生的斑马鱼尾部椎管膨隆，可能与尾部异位表达miR—125有关。
5.miR—124和miR—125在胚胎发育过程中可能具有协同作用。