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本研究以6个核桃品种为试材采用11个处理进行了无融合生殖诱导,并用SSR分子标记对直接套袋隔离获得的无融合生殖核桃后代与母本进行鉴定。本研究还分析了核桃EST-SSR特点,初步探讨利用核桃EST序列开发EST-SSR标记的可行性。主要研究结果如下:
1、6个核桃品种的无融合生殖平均诱导率为17.19%,薄壳香的诱导率最高为46.61%;雌先型的诱导率明显高于雄先型;药剂组合处理优于单一药剂,以0.2%的秋水仙素+2%的二甲基亚砜平均诱导率最高为22.38%;各品种对不同药剂的敏感性不同,薄壳香对1%二甲基亚砜最敏感,诱导率最高为72.88%;经新复极差法分析,除木田峪6号、4-30、北京746三者在0.05水平差异不显著外,其余各品种间差异显著。
2、进行5因素(Taq酶、Mg2+、DNA模板、dNTPs及引物)4水平正交实验,建立了核桃SSR扩增最佳反应体系(20μl):0.75U Taq酶、2.5 mM Mg2+、0.4μM Primer、0.3mM dNTPs、20ng模板DNA、双蒸水补足20μl。
3、用SSR分子标记,每个品种选出10对母本具杂合位点的引物进行无融合生殖核桃子代鉴定。结果表明:子代出现无扩增的频率为0.74%,与母本带型相同的频率为46.30%,母本微卫星杂合位点分离的频率为47.22%,出现新型带的频率为5.74%;同一品种母本与子代、子代各个体之间有较大差异;子代SSR位点变异可能与基因型有关。
4、从dbEST数据库用SSRHunter软件对4500条核桃EST序列进行搜索,EST-SSR出现频率为10.27%,平均每5.65kbEST出现一个SSR。二核苷酸重复基序占主导地位,其次为三核苷酸,分别占总SSRR的49.57%和27.27%。二核苷酸EST-SSR的优势类型为AG,其次为AT,分别占二核苷酸SSR的67.25%和28.38%。三核苷酸优势类型为AAG,其次为ACC、AAT、AGG,分别占三核苷酸SSR的25.40%、21.43%、16.67%和11.11%。用Primer Primer5.0软件设计了11对引物,对核桃属5个样品进行PCR扩增,10对引物有扩增产物,引物有效扩增率为90.9%,其中7对引物有多态性,多态性引物占可扩增引物的70%。表明利用核桃EST序列开发EST-SSR标记是可行的。