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帕金森病(ParkinsonsDisease,PD)最早于1817年由英国医生JamesParkinson描述而得名,它是一种多发于中老年人的神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD),因而受到广泛的关注。 PD的临床表现主要为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓、运动减少以及姿势不稳等,它的病理改变主要为黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元的进行性丢失以及胞浆中路易小体的沉积。PD的发病机制,目前还不十分清楚。但近年来越来越多的研究表明,中枢神经系统的免疫炎症反应与PD的发病密切相关,而小胶质细胞作为中枢神经系统特有的免疫细胞介导了中枢神经系统的免疫炎症反应。静息状态下的小胶质细胞在受到一些损伤信号的刺激时,细胞体积增大、突起增多,成为阿米巴样活化的小胶质细胞。活化的小胶质细胞可产生一些具有神经毒性作用的物质,如IL-1β,TNF-α,NO,NOO-,O2.-,H2O2及MMPs等,这些物质可作用于神经元,引起神经元的损伤或者死亡。因此能够抑制小胶质细胞过度激活和分泌炎症因子的药物可能具有潜在的神经保护作用。 基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases,MMPs)是一类活性依赖于Zn2+、有降解细胞外基质作用的内肽酶家族。金属基质蛋白酶9(MatrixMetalloproteinase9,MMP9)属于MMPs家族的基底膜性胶原酶。近年来研究表明,在PD模型中,MMP9的表达升高,而加入MMP9抑制剂能明显抑制MPTP引起的DA能神经元的丢失。 远志是我国常用的传统中药材,为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWilld.或卵叶远志(西伯利亚远志)PolygalasibiricaL.的干燥根。始载于《神农本草经》,它被列为上品,视为养命要药。具有安神益智、祛痰,消肿等作用。远志富含皂苷类、寡糖酯类化合物,近年来现代药理学研究表明远志皂苷(Tenuigenin,TEN)是远志发挥抗衰老、抗痴呆,抗氧化应激和神经保护作用的主要有效成分,对神经系统疾病具有重要的作用。我们实验室的前期工作发现:在离体和整体PD模型中,TEN具有明确的神经保护作用(已申请国内发明专利,申请号:201010200579.8),作用机制与抗氧化应激有关。而进一步的研究表明,TEN的神经保护作用不仅与抗氧化应激有关,也与其抗炎作用相关。为进一步探讨TEN与中枢神经系统免疫炎症反应的关系,本研究以α-synuclein引起的小胶质细胞炎症模型为研究对象,观察TEN在这一模型中对MMPs、NO及炎症因子的作用。主要结果如下: 1小胶质细胞模型的建立 应用不同剂量(0,0.1nM,1nM,10nM,20nM,50nM,100nM)的α-synuclein作用于原代培养的小胶质细胞24h,通过明胶酶谱法检测细胞培养液上清中MMPs的含量,确定50nM的α-synuclein作为诱导小胶质细胞模型的有效剂量。 2TEN保护剂量的确定 应用不同剂量(10-6M、10-5M、10-4M)的TEN分别作用于原代培养的小胶质细胞24h后,通过和四唑化合物[3-(4,5-二甲噻唑2-烷基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑内盐;MTS]及一种电子耦合试剂(吩嗪硫酸乙酯;PES)反应检测细胞活力,确定了10-6M、10-5M、10-4M的TEN对细胞活力没有影响,可作为研究TEN保护作用的剂量。 3明胶酶谱法方法的验证及MMPs标准品剂量的选择 通过对不同剂量(0ng,1ng,2ng,4ng,8ng,16ng,32ng,64ng)MMPs进行明胶酶谱法检测发现,条带的灰度值与MMPs剂量之间呈良好的线性关系,并且确定MMPs标准品的剂量在8～10ng时为宜。 4TEN对α-synuclein诱导小胶质细胞产生MMPs的影响 应用不同剂量(10-6M、10-5M、10-4M)TEN预孵育原代小胶质细胞30min,然后加入α-synuclein使其终浓度为50nM,发现10-6M、10-5M、10-4M对MMPs的产生均有一定的抑制作用,且这种抑制作用随TEN浓度的增加而增强。用RT-PCR的方法检测MMPsmRNA水平的表达,发现TEN可剂量依赖性的抑制MMPsmRNA的表达。 5TEN对α-synuclein诱导小胶质细胞产生IL-1β、TNF-α及NO的影响 用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测细胞合成和分泌促炎因子肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα,TNFα)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)水平并用Griess反应方法检测NO水平,结果显示50nM的α-synuclein对原代小胶质细胞产生IL-1β、TNF-α及NO均无明显影响,但进一步实验显示5μM的α-synuclein可明显增加原代小胶质细胞产生NO。 结论 本研究首次发现中药单体TEN在α-synuclein诱导的原代小胶质细胞中的作用,TEN可抑制由α-synuclein诱导的原代小胶质细胞产生MMPs的增加,并且确定50nM的α-synuclein在激活小胶质细胞中是一种比较弱的刺激,而在这种刺激作用下小胶质细胞产生MMPs增加,并且TEN能对其有一定的抑制作用,沿着这一方向继续深入研究可能会开发出具有中国自主知识产权的神经保护药物,为防治PD等神经退行性疾病提供新的选择。