论文部分内容阅读
目的:在过去几年的临床工作中发现了多个不相干的家系的婴儿中,由于IER3IP1（立即早期反应3相互作用蛋白1）基因常染色体纯合子突变,而患上一种名为MEDS综合症的疾病,这种病表现包括新生儿糖尿病症状,同时伴有小脑症、减化旋转、癫痫等神经系统疾病,从而引起了人们对此蛋白的重视。目前对于IER3IP1功能的研究,主要归纳为两点:1、当内质网不能维持稳态时会造成内质网应激,内质网应激激活未折叠蛋白反应（UPR）试图恢复稳态,而IER3IP1缺乏会抑制了UPR反应,导致内质网应激无法控制;2、IER3IP1与酵母菌中的yos1p蛋白同源,yos1p协同copII（外套蛋白）,参与了分泌蛋白由内质网转运到高尔基体的过程,所以推断IER3IP1可能也有同样的功能。本实验主要从IER3IP1引起新生儿糖尿病入手,关注其对胰岛素前体的生物合成以及对内质网稳态和质量控制系统的影响。由于既往对IER3IP1文章的报道较少,首先我们确定IER3IP1在人类,大鼠以及小鼠物种中的高度保守性。其次,研究IER3IP1对胰岛素前体的生物合成的作用。再次,由于IER3IP1定位于内质网中,所以可以推测IER3IP1可能作用于内质网质量控制系统,所以本实验预检测其对内质网相关降解途径的作用以及检测内质网应激相关指标。本研究根据以上推测,设计实验方案。方法:首先,为了证明IER3IP1基因在各物种中的高度保守,分别根据小鼠和大鼠PUNMED网页中提供的IER3IP1 cDNA设计引物,提取INS-1细胞（大鼠胰岛细胞）和MIN6细胞（小鼠胰岛细胞）的mRNA,逆转录为cDNA,分别用两种引物利用PCR技术扩增cDNA,跑DNA胶找到相应碱基位置的条带,切胶并回收,提取DNA送测序。第二,利用Crispr-CAS9技术将HEK293T细胞中的IER3IP1基因敲除,通过western blotting检测IER3IP1蛋白水平,验证敲除成功。第三,分别将野生型HEK293T细胞和IER3IP1细胞中转染信号肽R6C突变的（胰岛素原信号肽第六位由精氨酸突变成半胱氨酸,影响了前胰岛素原进入内质网的效率）胰岛素原前体质粒,观察胰岛素原前体和胰岛素原在两种细胞中的比例。第四,分别在野生型HEK293T细胞以及IER3IP1-/-HEK293T细胞中分别转入野生型胰岛素原质粒,1)分别收集细胞和上清中的蛋白,比较每组细胞内和上清中胰岛素原的比例。2)将收集到的细胞蛋白取出相同的两份,其中一份加入100nM的DTT,观察每组形成错误折叠蛋白情况。同样方法转入野生型带myc标签的甲状旁腺素质粒,观察IER3IP1是否影响其他分泌蛋白的分泌功能。第五,将野生型HEK293T细胞中分别转入野生型胰岛素原质粒以及Akita质粒,利用免疫共沉淀技术,用自制的胰岛素原抗体做免疫沉淀,将免疫沉淀后的蛋白进行western blotting检测,验证IER3IP1是否直接结合胰岛素原,协助其转运。第六,将两种细胞中均转入Akita突变（胰岛素A链第七位半胱氨酸突变成酪氨酸）的胰岛素原质粒,人为建造一个由于胰岛素原错误折叠堆积而导致内质网应激的细胞模型,检查两种细胞内质网应激相关蛋白的指标,观察IER3IP1对内质网应激的作用。第七,野生型及IER3IP-/-HEK293T细胞同时转入Akita突变以及信号肽R6C突变的前胰岛素原质粒,转染24小时候,将每组中细胞平均分成两个孔,Akita组其中一个孔放线酮（CHX）处理5小时,R6C组处理30分钟,对每组放线酮处理的细胞和未处理的细胞中的胰岛素原的量作对比,观察Akita胰岛素原以及R6C前胰岛素原的降解情况。结果:1.通过对大鼠和小鼠IER3IP1 cDNA的测序,并与人类IER3IP1基因进行比对,发现此基因在物种件具有高度保守性。2.通过crispr-cas9技术,敲除HEK293T细胞中的IER3IP1基因,经western blotting检测,敲除后细胞中的IER3IP1蛋白水平明显降低。3.IER3IP1缺失不影响胰岛素原前体向内质网的转位。4.通过对野生型胰岛素原和野生型甲状旁腺素原在HEK293T细胞以及IER3IP1-/-HEK293T细胞中及上清中蛋白量的比对发现,IER3IP1不仅参与了胰岛素的分泌同时也参与了其他分泌蛋白的分泌。5.通过免疫共沉淀方法发现,IER3IP1既不与野生型胰岛素原结合,也不与突变的AKITA直接结合。6.在IER3IP1敲除的HEK293T细胞中,内质网应激相关蛋白表达（BIP、p-EIF2α）较野生型的HEK293T细胞升高,但如果细胞中出现错误折叠的胰岛素原,其内质网应激相关蛋白表达量较野生型细胞减少7.HEK293T细胞敲除IER3IP1基因后,可使错误折叠的Akita胰岛素原降解减少,而对于信号肽突变的前胰岛素原R6C降解无明显作用。结论:1.本实验验证了IER3IP1在各物种间的高度保守性。2.成功建立了IER3IP1蛋白敲除的HEK293T细胞系。3.IER3IP1敲除后胰岛素原分泌减少且胰岛素原错误折叠堆积,其他分泌蛋白如甲状旁腺素原蛋白分泌亦减少。4.IER3IP1不直接结合野生型胰岛素原和错误折叠的胰岛素原,并不直接协助分泌蛋白转运到高尔基体。5.IER3IP1的敲除增加了内质网应激,但当细胞内出现错误折叠蛋白时,内质网应激激活程度减低。6.IER3IP1在内质网相关降解通路中发挥作用,IER3IP1缺失可导致错误折叠蛋白降解减慢。但对于没有进入内质网的蛋白,无明显作用。说明IER3IP1只与内质网相关降解有关。