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漆酶(Benzenediol:oxygen oxidoreductase,ECI.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,是自然界降解木质素的三种主要的木质素降解酶之一,是有效转化地球上最大的可再生资源纤维素最关键的因素。
随着研究的深入,漆酶对与木质素前体物质分子结构相似的许多环境污染物的降解作用倍受到人们的关注,尤其在纸浆生物漂白、工业废水处理、染料脱色、环境污染物质的去毒与降解、食品饮料、生物检测和生物修复等方面,显示出较大研究价值和广泛的应用前景。大多数真菌有在天然条件下生长缓慢,产漆酶活性低,产量低,可适应温度和pH值范围较窄,漆酶价格昂贵等缺陷,导致漆酶的工业化生产受到限制。要解决上述诸多的实际应用问题,提供高效、清洁、低成本的漆酶酶源是漆酶工业化应用迫切需要解决的问题。
通过常规的诱变育种手段,进行优质高产菌种的种质创新,已经取得了良好的效果。然而,该途径要求大量的人力、物力,而且选育周期较长。
本研究在对漆酶基因的结构与功能、分子进化机制等方面进行比较分析的基础上,通过生物信息学技术对各种漆酶蛋白质结构进行比较与分析,找出影响漆酶温度和pH值稳定性的氨基酸的关键位点,对已测序的白腐菌TR16和灵芝TR6两种菌株漆酶蛋白质序列进行定点改造,并通过蛋白质二级结构比对进行验证,为TR6和TR16两种菌种漆酶实际改造提供重要的理论预测。
本实验利用多个蛋白质序列信息比对的分子设计方法,将灵芝TR6和白腐菌TR16菌株的漆酶与其他同源性较高的真菌漆酶进行比较,发现高低温漆酶和高低pH漆酶间的差异。再以其为指导对灵芝JR6和白腐菌TR16菌株的漆酶进行改造,从而降低分子设计的风险,并能够在缺少三级结构信息的条件下完成对其他真菌漆酶的参照,同时免去了后期高通量的筛选,降低了成本。以期最终获得能够适应高温高pH环境的生产用漆酶。
本研究取得如下结果:
(1)将高温与低温的漆酶氨基酸序列与TR6和TR16漆酶用ClusterX软件进行比对,发现比对结果第495号位点有明显差异,高温漆酶在495号位上都是甲硫氨酸,而低温的都是苯丙氨酸。然后将高温低温漆酶的蛋白质二级结构用软件进行预测比对,氨基酸序列第212～214号位点TQY附近低温漆酶与高温漆酶二级结构有着明显差异,高温漆酶在该位点均为Q螺旋,而低温漆酶为无规则卷曲,这一标志可作为蛋白是否改造成功的检验标准。当将TR6和TR16的489号位点的苯丙氨酸换成甲硫氨酸,经比对,氨基酸序列第135～137号位点附近,漆酶TR6与TR16由低温性状的无规则卷曲变成Q螺旋,这一改变与高温漆酶二级结构相符。结果表明,要将TR6与TR16漆酶变成耐高温漆酶,可以在489号进行定点突变,将苯丙氨酸换成甲硫氨酸。
(2)将高pH值与低pH值漆酶的氨基酸序列与TR6和TR16漆酶用ClusterX软件进行比对,发现比对的氨基酸序列第287号位点有明显差异,高pH值漆酶在287号位上都是赖氨酸,而耐低pH值的都是亮氨酸。然后将高pH值低pH值的蛋白质二级结构用软件进行预测比对,氨基酸序列第295～296号位点低pH值漆酶与高pH值漆酶二级结构有着明显差异,高pH值漆酶在该位点多了一个α螺旋,而低pH值漆酶为无规则卷曲,这一标志可作为蛋白是否改造成功的检验标准。当将TR6的195和TR16的194号位点上的亮氨酸改为赖氨酸,经比对,氨基酸序列第225号位点附近,漆酶TR6与TR16由低温性状的无规则卷曲变成Q螺旋,这一改变与耐高pH值漆酶二级结构相符。可以说明,要将和TR6与TR16漆酶变成耐高pH值漆酶,可以在194号进行定点突变,将亮氨酸改为赖氨酸。