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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种猪的急性肠道传染病,其主要特征为呕吐、腹泻、脱水和哺乳仔猪高死亡率。近年该病对我国养猪业的危害特别严重,导致严重的经济损失。本研究以建立的RT-PCR技术对2012-2013年四川部分地区的流行情况进行了调查,同时对S基因进行了序列分析,掌握四川PED的流行情况,为四川地区该病的科学防控提供依据。1.RT-PCR检测方法的建立与应用参照GenBank参考毒株CV777的M基因序列,应用PrimersS.0软件设计一对检测引物,预期扩增392bp的特异基因片段,建立了RT-PCR检测技术。经PCR反应条件的优化,确立了最佳反应体系：MgCl2浓度为1.75 mmol/L, Taq酶浓度为0.05U/μL, dNTP浓度为125 μmol/L,引物浓度为0.55 pmol/L。最佳循环条件为：94℃预变性3 mmin；94℃变性30s,54℃做退火梯度30s,72℃延伸30s,重复35个循环；72℃补充延伸10 mmin。以猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒等为对照进行特异性试验,同时经临床检测证明该方法效果确实,有较高的特异性。敏感性试验结果显示该方法最低可以检测出RNA浓度为138 ng/mLo运用建立的RT-PCR方法检测了四川9个地区送检的75份仔猪腹泻病料(小肠及粪便),有66份病料为PEDV阳性,腹泻病料中PEDV阳性检出率为88.00%。结果分析表明：9个地区均检出PEDV,集中分布在四川中部、东部地区；从发病年龄看,各年龄的猪都有感染,但死亡多发生在四周龄以下的哺乳仔猪,发病季节除冬春季节外,近年夏季也呈高发趋势；与其他腹泻病原(猪轮状病毒、传染性胃肠炎病毒)相比,四川地区腹泻病原中,PEDV感染仍然占主要地位。2.四川地区PEDV的S基因部分序列的克隆与分析针对S基因设计引物,扩增大小为947bp。选取四川地区检测为PEDV阳性的9份代表样品,扩增了S基因片段,并进行基因测序,与GenBank上发表的14条国内外PEDV部分S基因序列比对分析,并进行遗传进化分群。核苷酸及氨基酸同源性分析显示：核苷酸序列同标准毒株CV777相比,9个毒株均存在核苷酸的点突变、插入突变和缺失突变；推导的氨基酸序列同毒株CV777相比,9株PEDV部分S基因均存在氨基酸插入或缺失的现象。核苷酸系统进化树分析显示：基于S基因的系统树将PEDV毒株分为2群G1和G2,其中G1和G2又被分为2个亚群即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。2012-2013年四川地区的9个基因主要集中于G2-2亚群的一个大分支上,除中国早期分离株DX(甘肃,2007)独在G2-1分支上,其余国内外分离株分布于G1、G2群内。近几年我国PEDV流行毒株分布于其中3个亚群内,分别是G1-1、G2-1、G2-2。G2-2亚群包括的毒株相对复杂,既有我国以前的地方毒株,也有本次研究的2012年四川地区流行毒株,以及早期国外分离毒株CV777、BR1/87。从S基因序列同源性来看,G2-2亚群内的国内外参考毒株与本研究的9株分离毒株的同源性较高,其次是G2-1亚群内的参考毒株,G1群内的参考毒株与9株分离毒株的同源性最低。与9株分离毒株S基因长度相比,由于存在碱基缺失或插入现象,导致它们的长度相差不一。S基因同源性分析结果表明：四川地区2012-2013年流行毒株具有多样性,但大部分流行毒株与我国以前的流行毒株不同,不但核苷酸序列同源性较低,而且存在大量核苷酸点突变和碱基缺失、插入现象。推导氨基酸序列同标准毒株CV777相比,9株PEDV部分S基因均存在氨基酸点突变、插入或缺失的现象,主要集中于G2-2亚群中的一个大分支上,氨基酸插入或缺失突变主要集中在39-75aa区域内,与标准毒株CV777部分S蛋白氨基酸序同源性为93.7%-96.6%,氨基酸突变率为3.4%-6.3 %,而9株PEDV毒株的核苷酸插入、缺失及大量氨基酸突变所引起的抗原位点的变化与分子特征改变有待进一步研究。