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黑果枸杞(Lycium ruthenicum)，茄科枸杞属多年生灌木植物，是我国西北荒漠地区的典型植物，在新疆、青海、内蒙古等地多有分布。黑果枸杞具有抗击干旱和耐盐碱的特性，常分布于盐碱荒地、盐湖岸边或盐化沙地等盐渍化土壤中，非常适应在盐渍土中生活。黑果枸杞果实呈蓝紫色圆球状，味道微甜。有研究表明，黑果枸杞中含有丰富的维生素C和人类所必需的氨基酸和脂肪酸。而黑果枸杞稍低的含糖量与丰富花青素含量可以代替红果枸杞称为制药原材料和工业染色剂。 黑果枸杞作为中国西部典型物种，在繁育手段及分子生物学特性方面都鲜有研究。本研究在通过获得黑果枸杞转录组数据的基础上进行全转录组水平开发微卫星多态性引物，从而研究不同种源地黑果枸杞之间的亲缘关系与遗传多样性。本研究的主要内容有: 1黑果枸杞转录组水平基因分析EST-SSR的位点分布与统计: 通过网络数据库与Illumina2000测序平台构建黑果枸杞转录组数据库，共获得68，083个unigene，注释结果显示，共有53，366个unigene被注释，注释类型包括NR、NT、COG、KEGG、GO和Swiss-Protocol等类型。这些注释的结果表明我们获得的转录组测序结果是非常可靠的，能够能用于黑果枸杞后续的其他研究中。 使用SSRIT在线微卫星扫描平台，共鉴定出9，216个EST-SSR位点，出现频率为1/6.48kb，意味着平均每6.48kb就会出现一个SSR。这些SSR中，大多长度为12-22bp(88.27％)，长度为23-30bp和大于30bp的频率分别为3.37％与4.47％。从SSR数量上来看，三基元以上重复中出现最多的是三碱基SSR，有2，563个，总长度为43，215bp，占SSR总数的27.81％，其中较多的是ATC/ATG、AGC/CTG和AGG/CCT。从SSR重复基元上看，重复种类最丰富的是六碱基SSR，共有61种，其次是五碱基SSR有23种。由此可知，黑果枸杞的六碱基最易于变异，其他种类倾向于保守。在所有SSR重复类型中，数量最多的是AG/CT，为1，166个，其实是AAG/CTT，为698个。由此可见，基于黑果枸杞转录组数据的EST-SSR位点还是相当丰富的。 2 PCR扩增与体系优化: 根据SSR位点，应用DNAMAN软件设计引物，共设计并合成77对引物。这些引物所能扩增出来的基因在转录组数据库中均已知功能或根据其相似物种预测出其功能。黑果枸杞叶片DNA提取后，通过PCR扩增后使用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示其中有69对能清晰扩增出目的条带，则该69对引物能够应用于后续工作。 使用正交试验L16(44)设计16组优化体系，在PCR结果检测中得到了最优组合，即DNA10 ng，引物浓度0.5μmol/L，Taq酶0.2U，dNTP浓度0.2 mmol/L，并使用3组随机引物验证了其稳定性。 3 EST-SSR标记开发与多态性引物的筛选: 通过采集阿拉善、格尔木、沙雅等10个种源地的黑果枸杞叶片，使用CTAB法提取DNA后，分别使用69对引物进行扩增，扩增率高达89.6％。扩增产物使用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行引物多态性结果检测。选取其中扩增条带清晰、多态性良好的D1、U20、U36等11对引物，重新合成并在5端分别加FAM、ROX、HEX和TAMRA四种荧光。使用荧光引物重新扩增10个种源地黑果枸杞后，进行毛细管电泳检测，并获得扩增条带大小。毛细管电泳结果分析表明这些引物能够有效区分10个种源地的黑果枸杞，是非常合适的。 4不同种源地黑果枸杞的遗传多样性分析: 通过聚类分析构建系统树显示10个种源地的聚类结果基本是按照地理位置的远近归类的。Nei氏遗传距离分析也表明10个种源地黑果枸杞的远近与地理距离紧密相关。而根据遗传距离的主成分分析将10个种源地归为4类，这4类几乎是按照地理位置分类的，这也绝不是偶然。 近交系数反映了黑果枸杞并没有产生严重的近交衰退，适合度体现了其后代比较容易未来在环境中存活。在11个SSR位点中，D1位点由于重复基元为6个，变异率非常高，而有3个位点的等位基因频率分布最为均匀。我们又由基因流分析推测各个种群间的基因交流可能是比较大的。 目前，国内外对黑果枸杞的研究都不甚详尽，而通过基于转录组数据的黑果枸杞EST-SSR标记的开发，我们可以进一步探索不同种源地黑果枸杞在亲缘关系上的远近，研究造成同种源地个体差异性的关键因素。实现通过分子遗传标记的方法研究和获得更多优良的种质资源，从而为我国林木遗传育种事业提供切实有效的手段。