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酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）是一类广泛存在于细胞膜上的阳离子通道,H+是最早发现的ASICs通道激动剂,开放的通道对Na+、Ca2+具有可通透性,参与细胞病理生理功能的改变。自噬（Autophagy）是一种依赖于溶酶体的细胞自我降解过程,具有多种生理病理功能。本课题组前期研究发现大鼠关节软骨细胞存在ASICs表达,胞外酸化刺激软骨细胞,细胞自噬水平升高,细胞凋亡增加,但具体机制尚不明确。本研究选用大鼠关节软骨细胞为研究对象,胞外酸化刺激软骨细胞为体外模型,采用小分子干扰RNA（si RNA）技术沉默ASIC1a基因表达,探讨ASIC1a对胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的影响及其可能机制。目的:本研究旨在观察ASIC1a对胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬活化的影响,并探讨其可能的分子机制。内容:1.观察不同的胞外酸化刺激条件下,大鼠关节软骨细胞自噬水平变化;2.利用小分子干扰RNA（si RNA）技术建立体外ASIC1a的表达沉默模型并验证其沉默效率;3.观察沉默或阻滞ASIC1a后,关节软骨细胞自噬水平的变化;4.探讨ASIC1a参与胞外酸化诱导关节软骨细胞自噬活化的机制;方法:1.不同胞外酸化条件（pH7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0）/（pH6.0刺激15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h）,作用于大鼠关节软骨细胞,通过Western-blot法检测自噬蛋白LC3Ⅱ表达。2.通过合成特异性荧光短链ASIC1a si RNA-FAM建立体外ASIC1a表达沉默模型,采用荧光倒置显微镜、Western-Blot及实时荧光定量PCR（q-RT-PCR）法检测ASIC1a沉默效率和对ASIC1a m RNA和蛋白表达的影响;3.选择大鼠关节软骨细胞为实验对象,设正常组、pH6.0酸化模型组、Pc Tx1组（100ng/m L）、特异性ASIC1a si RNA沉默组、ASIC1a si RNA沉默阴性对照组,激光共聚焦技术检测胞内[Ca2+]i水平;吖啶橙染色（Arcidine Orange,AO）观察软骨细胞酸性小体形成情况;实时荧光定量PCR及Western-Blot法检测关节软骨细胞自噬相关基因LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量;4.选择大鼠关节软骨细胞为实验对象,设正常组、pH6.0酸化模型组、BAPTA-AM组、特异性ASIC1a si RNA沉默组、ASIC1a si RNA沉默阴性对照组、BAPTA-AM+特异性ASIC1a si RNA沉默组,GFP-LC3质粒转染观察细胞内LC3水平;实时荧光定量PCR及Western-Blot法检测关节软骨细胞自噬相关基因LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量;5.关节软骨细胞胞外酸化刺激,采用Western-blot法检测各组细胞Ca MKKβ、AMPK、m TOR的磷酸化水平;6.胞外酸化刺激大鼠关节软骨细胞,设正常组、pH6.0酸化模型组、3-MA自噬抑制剂组、特异性ASIC1a si RNA沉默组、ASIC1a si RNA沉默阴性对照组、3-MA+特异性ASIC1a si RNA沉默组,Hoechst33342染色分析细胞凋亡情况;流式细胞术观察细胞凋亡;实时荧光定量PCR法检测关节软骨细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的含量。结果:1.胞外酸化刺激大鼠关节软骨细胞,自噬标志性蛋白LC3Ⅱ呈时间和pH依赖性增加,且在pH6.0,3h时表达量达到最大水平;2.化学合成的特异性ASIC1a si RNA可成功转染入大鼠关节软骨细胞,转染后,软骨细胞ASIC1a m RNA和蛋白水平显著下调;3.采用ASIC1a阻滞剂Pc TX1和ASIC1a si RNA可导致关节软骨细胞胞内Ca2+浓度降低,并且可以抑制胞外酸化诱导软骨细胞自噬活化,表现为:LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1表达量显著下调,AO染色结果表明细胞内酸性自噬溶酶体数目减少;4.ASIC1a si RNA和BAPTA-AM组中胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬活化减少,表现为:LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1的水平显著下调,细胞内GFP-LC3数目减少。5.沉默ASIC1a组或BAPTA-AM组可抑制胞外酸化诱导的Ca MKKβ及AMPK磷酸化水平升高和m TOR磷酸化水平降低。6.沉默ASIC1a或3-MA自噬抑制组,Bax m RNA表达量下降,Bcl-2 m RNA表达量升高,软骨细胞凋亡程度显著下降。结论:1.ASIC1a参与胞外酸化诱导大鼠关节软骨细胞自噬活化过程;2.ASIC1a si RNA转染可成功构建体外关节软骨细胞ASIC1a表达沉默模型;3.沉默或抑制ASIC1a抑制酸化导Ca2+超载,抑制酸化诱导的自噬活化;4.ASIC1a通过调节Ca MKKβ、AMPK、m TOR信号通路发挥抑制胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞自噬活化作用;