具有漆酶作用内生真菌的筛选分离及其特性研究

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漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一种含有多个铜原子的多酚氧化酶,1883年日本人吉田首次在漆树中发现漆酶,被Bertrang定义为含金属的氧化酶。漆酶能够氧化多种芳香族化合物,能将有毒的酚类化合物转化为无毒性物质,还可降解木质素及其衍生物、除去石油工业中的有毒物质。近年来,它在环境污染物的降解与脱毒、纸浆的生物制造与漂白、染料的脱色与脱毒、木质素及其衍生物的降解、转化以及食品性状的改良等领域得到广泛的应用,体现了漆酶良好的生态效益和经济效益。因此,对漆酶及其产漆酶菌株的研究具有一定的理论和现实意义。   本论文首先从多年生草本植物甜叶菊中筛选出154株内生真菌,其中从叶、茎、根分别得到42、50、62株,并对其进行初步鉴定;然后利用平板显色特征,通过将这154株真菌接种到含有鞣酸、愈创木酚及a-萘酚的的培养基上,观察平板的显色情况,结合菌、株自身的生长速度,选择出了15株进行发酵复筛,进行发酵培养,利用ABTS法检测漆酶产量的过程发现大部分菌株产酶量最大的时间在液体发酵后10天附近,其中有三株产漆酶量最大,分别为L02、L38、R28。对这三株菌株考察了产漆酶时间、产酶量及生物量的大小后确定138为高产漆酶最优的菌株。   对L38菌株进行发酵条件优化的研究,利用单因素实验确定了最佳碳源为马铃薯和玉米粉的混合碳源,氮源为NH4Cl,无机盐离子为Cu2+、Mg2+;利用响应面实验确定影响L38产酶量大小的三个关键因素为温度、氮源、装液量;经过优化后的产酶培养基及培养条件为:马铃薯150g/L、玉米粉10g/L、NH4Cl1.69g/L、CuSO4·5H2O0.05g/L、MgSO40.2g/L、K2HPO41g/L、KCl0.5g/L,pH自然,装液量为80mL/250ml、转速110r/min、培养温度为28℃。优化后菌株的漆酶产量为508.68U/L,为优化前基础培养基的5倍左右。   将粗酶液通过硫酸铵分级沉淀得到含杂质较少的漆酶蛋白。纯化后的漆酶最适反应温度为60℃,在50℃保温1 h仍能保持80%以上的活力,温度稳定性较好;最适pH为3.0,在pH3.0~7.0的范围内于25℃保温24h仍能保持在80%以上的活力;Cu2+、Zn2+、Mn2+、K+对该酶酶活力有促进作用,Co2+、Ag+、Mg2+对酶活的影响不大,Fe3+、Fe2+对酶活力有明显的抑制作用;以ABTS(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)为底物时,漆酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为0.821mmol/L和357.14μmol/(L·min)。   对L38发酵液在处理剑麻纤维应用方面进行研究,结果显示该菌的发酵液可以去除剑麻纤维表面的木质素、果胶等物质,使纤维表面光滑、柔软,并且具有一定的漂白作用;对处理后的剑麻纤维进行拉力测试显示,处理后剑麻纤维承受的最大拉力损失较小;而处理后的剑麻纤维干重减少了1/8,纤维直径减少了1/4。  
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