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目的:研究富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing Gprotein-coupled receptor5,Lgr5)是否标记增殖期造血干/祖细胞(hematopoieticstem and progenitor cells,HSPCs)。 方法:鉴于胚胎造血及造血干细胞的发育涉及多个解剖部位的特点,为了准确评价Lgr5在胚胎期造血组织中的表达模式,更好地了解其在胚胎造血中的作用,我们采用Lgr5-EGFP转基因小鼠,获得Lgr5GFP/+胚胎或Lgr5+/+胚胎(阴性对照),以其作为研究对象,首先利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)和流式细胞分析术,研究Lgr5在胚胎发育不同阶段的造血组织或器官中的表达,探讨其动态表达的规律。然后在其高度表达时期,利用免疫组织化学(immtnohistochemistry, IHC)法,对表达Lgr5细胞在卵黄囊、主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区、胎盘及胎肝脏进行定位,在表达时间和位置上确定Lgr5表达是否与造血干/祖细胞增殖有关;同时,利用BrdU标记和增殖细胞标记抗原Ki67的双重免疫荧光染色(double immunofluorescence staining,DIFS)方法,研究表达Lgr5细胞是否处于增殖状态;利用流式细胞术分析表达Lgr5细胞是否表达造血细胞及造血干细胞的表面标记,确定表达Lgr5细胞是否具有造血干/祖细胞的表型特征。最后,利用流式细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)纯化表达Lgr5细胞,一方面利用Q-RT-PCR法检测表达Lgr5细胞是否表达与造血干/祖细胞出现/成熟/扩增密切相关的转录因子,另一方面,通过克隆形成细胞分析(colonyforming cell assay, CFC)和重建分析(repopulation assay,RA)的方法,对表达Lgr5细胞的体内、外的多谱系分化和自我更新能力进行检测。 结果:Lgr5在造血组织中的表达是动态的;在小鼠胚胎发育11.5~12.5天(E11.5~E12.5),Lgr5在AGM区、胎盘和胎肝中高表达。在此期间,表达Lgr5细胞主要在AGM区和胎肝经历扩增。表达Lgr5细胞位于造血祖/干细胞在早期胚胎中出现/成熟/早期扩增的位置:表达Lgr5细胞主要位于AGM区(E11.5~E12.5)的腹主动脉壁及其周围间充质的腹侧(确定型造血干细胞经历成熟和扩增的位置)、胎盘(E11.5)血管迷路区的胎儿血管和胎肝(E11.5~E12.5)血窦内,在造血前体细胞经历扩增的E7.5卵黄囊血岛内,也发现大量表达Lgr5细胞;多数表达Lgr5细胞与BrdU整合,表达细胞增殖标记Ki67;表达Lgr5细胞表达胚胎期造血干细胞活性出现/维护/增殖/成熟的关键基因Runx1、Gata2和Lmo2;我们也检测到部分表达Lgr5细胞表达造血细胞及造血干/祖细胞表面标记CD45、CD41、C-Kit和CD34;最后,Lgr5-GFP+细胞的克隆形成细胞分析和重建分析结果显示,表达Lgr5细胞具有体外多谱系分化的能力,然而,在体内只能低效率的植入受体小鼠骨髓,进行多谱系分化和短期的自我更新。 结论:Lgr5在早期胚胎的造血组织中表达;Lgr5的表达与表达Lgr5细胞的扩增及其在不同造血组织间的迁移有关,在E12.5胎肝的造血干/祖细胞池建立中起作用;胚胎造血组织中的表达Lgr5细胞,在有限时间段内,主要在AGM区和胎肝中扩增;表达Lgr5细胞具有发育着的造血干/祖细胞表型特征;Lgr5标记处于增殖状态的造血祖细胞;仅一部分表达Lgr5细胞具有短期造血干细胞(short-term HSCs,ST-HSCs)特征,长期造血干细胞(long-term HSCs,LT-HSCs)不表达Lgr5。这与在胚胎发育过程中Lgr5支持造血祖细胞快速增殖,以满足胚胎快速发育的的功能相一致。