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研究目的:从细胞生物学层面来看,脂肪组织的积累是脂肪细胞数量的增加和单个细胞体积增大的结果。脂肪细胞的数量由多潜能干细胞向前体脂肪细胞分化的多少来决定,而单个细胞的体积则与其从前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化程度和甘油三酯积累程度相关。PCAF是本课题组在群体遗传学水平发现的一个肥胖关联基因。作为一个组蛋白乙酰转移酶,PCAF可以通过催化核心组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化,使染色质处于活化状态,促进基因的转录,但PCAF在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中如何发挥作用尚不清楚。本研究的目的是应用体外脂肪细胞分化模型探讨PCAF是否参与脂肪细胞分化的转录调控及其发挥作用的分子机制。方法及内容:本研究以3T3-L1前脂肪细胞模型为研究对象,应用Real-time PCR法检测PCAF在3T3-L1细胞分化过程中表达水平的变化;用包含shRNA或ORF序列的重组慢病毒感染细胞,经嘌呤霉素和流式细胞仪筛选,构建PCAF表达上调或下调的稳定细胞株;通过细胞计数法和Oil-Red-O染色法观察PCAF表达量变化对细胞增殖及分化的影响;应用Real-time PCR Arrray和Ch IP on chip筛选正常3T3-L1细胞株在分化过程中PCAF参与调控的脂肪细胞分化相关基因。应用Western Blot蛋白印迹法和Ch IP qPCR对PCAF参与调控的靶基因进行验证。Real-time PCR得到的表达量倍数变化以均数±标准差(?X±s)表示;两组均数比较采用独立样本t检验,应用SPSS18.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.PCAF在细胞分化过程中的表达用Real-time PCR检测PCAF在分化day0、day2、day4、day6和day8的表达量,发现PCAF在3T3-L1细胞分化的day2表达升高,之后又逐渐降低。进一步细化时间点取样分析,发现相对于day0,细胞加入诱导培养基后10min、1h、6h和day2的PCAF表达量均升高,但在day1则略有下调。2.pcaf表达上调/下调稳定细胞株的构建重组慢病毒感染3t3-l1细胞,经筛选得到rna干扰稳定株(3t3-shb1)、过表达稳定株(3t3-pcaf)及对照组稳定株(3t3-control)。real-timepcr结果显示,相对3t3-control细胞株,pcaf的表达量在3t3-sh1中下调了73%(p<0.05),在3t3-pcaf中上调3.8倍(p<0.05)。3.pcaf表达变化对细胞增殖和分化能力的影响3t3-shb1、3t3-pcaf和3t3-control稳定株用正常培养液连续培养7天,绘制生长曲线,发现三种细胞的细胞增殖状态没有明显的区别;但pcaf敲低稳定株在加入诱导培养液后第8天,能被oil-red-o染色的细胞数量明显减少。4.pcaf参与脂肪细胞分化调控的分子机制(1)pcr-array实验对比3t3-shb1/3t3-control,3t3-pcaf/3t3-control发现,有3个脂肪细胞分化关基因的表达随pcaf的表达的上调/下调而上调/下调:分别是foxo1,cebpd及runx1t1。(2)制备正常3t3-l1细胞分化前(day0)和分化后(day2)的样本,应用pcaf抗体进行chip实验,洗脱得到的dna片段经启动子芯片检测后发现:在细胞分化前后,pcaf一直参与调控的基因启动子区共有2249个,将这2249个基因经pathway软件(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分析得到73个相关通路。进一步人工检索上述结果发现,foxo1的启动子区受pcaf的调控;pi3k、pdpk1、akt等基因也受到pcaf的调控,他们共同组成的胰岛素通路(kegg:mmu04910)在pathway分析结果中通过了多重检验(fdr=0.0439)。(3)我们用chip-qpcr检测了在分化不同时间点pcaf与胰岛素通路中的pi3k、pdpk1、akt以及foxo1基因启动子区的结合程度。结果发现,pcaf与pi3k、akt启动子区的结合在不同时间点没有明显区别;但pcaf与pdpk1启动子区在1h和day1结合较强,在10min和day2相对较弱;而pcaf与foxo1启动子区在10min、1h、day1结合较弱,在day2结合较强。应用real-timepcr检测pdpk1的表达,发现pdpk1的表达量在1h和day1升高。应用westernblot检测发现,akt的表达量不受pcaf表达量的影响,但akt的磷酸化程度在1h和day1随pdpk1的表达的上调而升高。foxo1的磷酸化程度同时也随p-akt表达的升高而升高。结论:1、pcaf在未分化和分化后的3t3-l1细胞中均有表达,且在分化后的细胞中表达量升高。2、对PCAF的干扰和过表达对细胞的增殖能力无明显影响。过表达PCAF对细胞的分化能力没有影响,但PCAF敲低细胞系的分化能力明显降低。证明PCAF确实参与了前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化调控。3.PCAF通过PDPK1/AKT/FOXO1通路发挥其对前脂肪细胞分化调控作用。分化初期,PCAF通过调控PDPK1的表达而影响AKT的磷酸化,进而调控FOXO1的磷酸化状态;在分化中期,PCAF直接上调了FOXO1的表达,协助细胞进入终末分化阶段。