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SARS冠状病毒(SARS-CoV)为单股正链RNA病毒,基因组全长约29 700nt,是目前所知的RNA病毒中基因组最大的一类病毒。序列分析表明,SARS病毒明显区别于所有已测序的冠状病毒,其系统发生关系不属于目前已知的3组冠状病毒中的任何一组,为一独立的分支。目前对SARS-CoV的基因组结构与功能、致病的分子机理等了解甚少,反向遗传学技术可为深入开展这一领域的研究提供良好的技术支持。反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,包括病毒基因组全长cDNA克隆的构建和感染性转录体的制备。但由于冠状病毒基因组较大,目前无法直接用PCR技术扩增出全长cDNA分子,而且构建基因组全长cDNA克隆必须使用大容量的载体,这就使全长cDNA克隆的构建较为困难。因此,本研究采用分段克隆、体外拼接及体外转录的策略开展了SARS病毒感染性转录体的制备工作。首先,对RT-PCR扩增SARS病毒基因组长片段cDNA的条件进行了优化。利用RNA制备试剂盒从病毒感染的细胞中提取总RNA,以SuperscriptⅡ进行反转录,合成第一链cDNA,然后用LA DNA Taq聚合酶进行cDNA片段的扩增。反应体系中采用不同的Mg2+、dNTP、引物和模板浓度以及不同的反应参数分别进行长片段cDNA的扩增,最终确定了扩增SARS病毒基因组长片段cDNA的最佳反应体系和参数:10×Buffer(Mg2+,37.5 mmol/L)缓冲液5μL,dNTP(10mmol/L) 2μL, LA Taq聚合酶(2.5U)1μL,上下游引物各1.5μL,模板2μL,加水至50μL。扩增条件为:94℃2min;94℃30s,55℃45s,72℃3.5～7min(依片段长度而定,1kb约需1min),扩增28个循环,每个循环延伸时间递增1s;最后72℃延伸7min,4℃保存。该反应条件具有很好的重复性。其次,对病毒全基因组进行分段扩增和克隆。利用SARS病毒BJ01株基因组序列上的特异酶切位点(BglI)和采用沉默突变引入BglI位点的方法设计了7对引物。扩增的7个cDNA片段其大小分别为1.5kb,2.8kb,4.3kb,3.3kb,6.8kb,4.5kb和6.3kb。同时,在基因组5′端引入T7启动子核心序列,以使其能够进行全长cDNA分子的体外转录。将扩增的覆盖病毒全基因组的7个cDNA片段进行回收纯化后,分别将F1片段克隆至pGEM-T Easy载体,将F2～F6克隆至pCR-XL-TOPO载体,将F7克隆至pWSK29载体构建SARS病毒亚cDNA克隆,并通过序列测定进行阳性克隆的筛选。最终构建出了F1-3-Teasy,F2-6-Topo,F3-17-Topo,F4-10-Topo,F5-1-Topo,F6-7-Topo和F7-pWSK29 7个重组质粒。在此基础上,对7个重组质粒进行大量提取、纯化、酶切和回收。然后分别将F1～F4和F5～F7进行体外连接获得SARS病毒基因组5′和3′端半分子cDNA,并对接头处序列进行了PCR扩增和序列测定。再将5′和3′端半分子cDNA进行体外连接,从而获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子。以获得的全长cDNA分子为模板直接进行体外转录,转录体转染Vero-E6细胞后每天观察细胞状态。结果在转染后84h,细胞出现空泡、聚集成团、变圆拉网等细胞病变。将收集的病毒培养液上清重新接种Vero-E6细胞进行观察,在72h后也出现相同的细胞病变效应。从出现病变的细胞中提取总RNA,对恢复病毒基因组序列的13 038～14 170nt和27 229～28 332nt两个区段进行RT-PCR扩增和测序,结果均与预期一致。这一结果表明,我们获得了BJ01株病毒的感染性转录体。SARS病毒BJ01株全基因组cDNA克隆及感染性转录体(拯救病毒)的获得为进一步确证SARS病毒毒力相关位点,探讨病毒致病的分子机理,开发嵌合疫苗、减毒疫苗以及构建新型病毒载体奠定了坚实的基础。