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目的作为移植患者术后抗免疫排斥的主要药物,环孢菌素A(CsA)已被公认为是移植术后新发糖尿病(PTDM)的危险因素之一,其中的分子机制可能涉及靶器官胰岛素抵抗、胰岛素分泌细胞凋亡以及胰岛素囊泡胞吐过程紊乱等,许多论点存有争议,需要进一步的的阐明。另一方面,环腺苷酸结合蛋白(Epac)的相关研究是胰岛素分泌机制以及新药研发领域的热点,它与c AMP相互作用,在胰岛素分泌的调节中扮演着重要的角色。本研究的假设为:CsA抑制胰岛素分泌的分子机制涉及胰岛beta细胞中的c AMP/Epac通路。方法(1)体外培养大鼠胰岛瘤细胞株INS-1 832/13细胞和INS-1细胞;(2)用不同浓度的CsA(0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)分别干预两种细胞24小时,倒置显微镜下观察细胞形态变化。(3)用上述不同浓度的CsA分别干预细胞24小时、48小时后进行MTT试验,检测CsA对胰岛细胞活性的影响。(4)用试剂盒提取细胞RNA,采用实时定量聚合酶链反应(q PCR)检测两种细胞株胰岛素合成相关基因m RNA以及细胞凋亡相关基因转录水平,包括pdx1,ins1,ins2,bcl-2,caspase-3,分析CsA对胰岛beta细胞胰岛素合成以及凋亡的影响。(5)高浓度葡萄糖刺激下胰岛素分泌试验(GSIS)对比CsA干预对胰岛素分泌的影响(6)酶联免疫法检测CsA干预对细胞内c AMP含量的影响。(7)提取细胞蛋白,采用Western Blot实验检测CsA干预对INS-1细胞Epac蛋白、CREB及P-CREB蛋白及凋亡相关蛋白(Cleaved-Caspase3,Bcl-2)表达的影响。结果(1)CsA干预INS-1 832/13细胞和INS-1细胞24小时后,倒置显微镜下观察两种细胞在较低浓度CsA(0.5μg/ml、1μg/ml)下几乎没有形态改变;处于5μg/ml CsA浓度下细胞状态开始变差;到高浓度CsA(8μg/ml、10μg/ml)时细胞状态极差,形态发生了明显变化,主要表现在细胞从星状转为圆形,皱缩变亮,有较多的死亡漂浮细胞及细胞碎片。(2)MTT结果显示:干预24小时,较低浓度CsA(0.5μg/ml、1μg/ml)干预INS-1 832/13细胞与对照组相比,测得的OD值各组间无明显差异,相对高浓度CsA(5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)干预组与对照组相比,OD值分别下降了5%、12%、23%;干预细胞48小时,较低浓度CsA(0.5μg/ml、1μg/ml)干预组与对照组相比,测得的OD值各组间无明显差异,相对高浓度CsA(5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)干预组与对照组相比,OD值分别下降了16%、29%、60%;在INS-1细胞的实验中,较低浓度CsA(0.5μg/ml、1μg/ml)干预细胞24小时后,干预组与对照组相比,测得的OD值有所下降,相对高浓度CsA(5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)干预组与对照组相比,OD值分别下降了51%、57%、69%;与上述细胞不同的是,INS-1细胞与CsA共同孵育48小时后,所有CsA干预组(0.5-10μg/ml)与对照组相比,OD值均显著下降,下降率分别为29%、43%、48%、77%、95%。(3)q PCR实验结果显示:较低浓度CsA(0.5μg/ml、1μg/ml)干预组与对照组相比,胰岛素合成调控基因ins1和ins2 m RNA的表达量相似。相对高浓度CsA(5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)干预组与对照组相比,表达量明显下降,而另一个胰岛素合成调控基因pdx1 m RNA的表达未受到CsA孵育的影响;(4)细胞内胰岛素含量测定结果显示:当CsA浓度为5μg/ml时,细胞内胰岛素含量明显下降,CsA+GLP-1干预组可以逆转此改变;GSIS结果显示:5μg/ml CsA干预组较NC组基础胰岛素分泌下降;高糖刺激后,环孢素干预组(1μg/ml、5μg/ml)较NC组胰岛素分泌量分别下降43%、57%;5μg/ml CsA+GLP-1干预组和NC组分泌量无明显差异;GLP-1干预组较NC组增加55%。(5)CsA干预细胞24h后,与对照组相比,凋亡保护蛋白基因bcl-2的表达略有下降;CsA孵育浓度为8μg/ml、10μg/ml时,对凋亡蛋白caspase-3基因的表达产生明显的上调作用。(6)Western blot实验结果显示:相应凋亡相关蛋白Bcl-2的表达没有发生显著的变化、Cleaved-Caspase3的表达在CsA浓度为5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml时明显上调。(7)酶联免疫法结果显示:1μg/ml和5μg/ml CsA干预后,INS-1细胞内c AMP的含量明显下降,加入GLP-1后,c AMP含量显著增加,表明GLP-1可明显改善CsA对胰岛素分泌的负面影响。(8)Western blot实验结果显示:1-10μg/ml CsA干预细胞后,胞内Epac蛋白表达明显下调。但是,同样浓度的CsA干预下,对细胞P-CREB/CREB未见明显影响。结论CsA对胰岛细胞的损害呈时间和剂量依赖性;CsA对胰岛beta细胞的作用可能与细胞株的不同有关,INS-1细胞对CsA的敏感性较INS-1 832/13细胞更强;c AMP/Epac通路可能参与CsA对胰岛细胞胰岛素分泌的损伤机制;GLP-1可以通过此机制逆转环孢素的损害作用;c AMP/CREB途径在CsA损伤胰岛细胞的机制中可能没有起到主要的作用。