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目的:探讨由实验室合成的鬼臼毒素衍生物ZM对人源骨肉瘤细胞Hos在体外的作用效果及机制,为抗骨肿瘤药物研制提供理论基础。
方法:
1.MTT法和SRB法检测ZM的体外抗肿瘤活性。
MTT法和SRB法测定ZM在体外对各种肿瘤细胞(Hos、KB、KBv200、Hela、BGC-823、MCF-7、SMMC-7721、HepG)及正常细胞(VEC)的IC50或G150值。
2.光学显微镜、荧光显微镜观察ZM作用后Hos细胞形态结构改变。
在对数生长期的Hos细胞中加入不同浓度ZM(1μM、2μM),作用于细胞24h,Giemsa染色后光学显微镜观察照相并保留结果。同法进行Hoechst33342荧光染色,以紫外光(340nm)激发Hoechst,荧光显微镜观察照相并保留结果。
3.琼脂糖凝胶电泳分析ZM对Hos细胞染色体DNA断裂的影响。
在对数生长期Hos细胞,加入不同浓度ZM(1μM、2μM)作用24h后抽提样本DNA,于1.5％琼脂糖胶电泳,电泳完成后用凝胶成像系统照相。VP-16(10μM)为阳性对照。
4.RT-PCR法检测不同浓度ZM(1μM、2μM)对Hos细胞bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3、PCNA mRNA表达的影响。
结果:
1.ZM的体外抗肿瘤作用。
本课题通过MTT和SRB法实验发现ZM对多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用,IC50范围在0.43μmol/L～9.87μmol/L之间,且对耐药细胞株KBv200也有抑制作用,IC50为6.67±0.22μmaol/L,具有抗多药耐药活性。但对正常细胞VEC IC50高于50μmol/L。同时,ZM对人骨肉瘤细胞(Hos)有较强的抑制作用,其IC50为1.32±0.51μmol/L。
通过绘制药物作用Hos细胞6天的生长曲线,发现不同浓度ZM对Hos细胞的生长抑制作用显著,且呈现较好的量效关系。
2.检测鬼臼毒素衍生物ZM诱导Hos细胞的凋亡的效果
把不同浓度ZM(1μM、2μM)作用于Hos细胞,24h后收集细胞。分别用Giemsa染料和Hoechst33342/PI荧光染料对细胞染色,前者能够将细胞核染为蓝紫色,胞浆染为粉红色。未加药组细胞的细胞核染色均一,结构完整且核浆比值较大;给药组的细胞能够看到细胞核的形态呈现出细胞凋亡典型特征:核膜皱缩,核固缩,核碎裂。用Hoechst33342荧光染料对细胞染色,在紫外光的激发下可发出蓝色荧光,在荧光显微镜下观察能够看到Hos细胞发生凋亡的细胞形态变化。细胞核内染色质出现集聚、碎裂,细胞膜也不断地出芽并脱落,细胞亦碎裂为数个大小不同的凋亡体,伴随着ZM浓度加大,镜下这种具有特征性的形态学变化的细胞数目愈来愈多,凋亡的细胞比例亦逐渐增高,显示出明显的剂量依赖关系。
在经典的DNA降解断裂检测实验中,用不同浓度ZM分别作用于Hos细胞24h,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可呈现典型的“DNA梯子样”图谱。
因此,综合以上可以认为鬼臼毒素新衍生物作用于Hos细胞时能够诱导细胞的凋亡。
3.ZM对Hos细胞凋亡相关基因bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3、PCNA表达的影响
本实验观察了ZM对凋亡相关基因bcl-2、bax、P53、P21、caspase-3和PCNA的mRNA表达的影响。经不同浓度的ZM(1μM、2μM)作用于Hos细胞24小时,RT-PCR结果显示ZM可上调bax、P53、P21、caspase3的mRNA表达,同时下调bcl-2和PCNA mRNA的表达,结果同对照组相比均有显著性差异(P＜0.05),且有一定的剂量依赖性。提示ZM诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调促凋亡基因bax、P53、P21、caspase-3表达,同时下调凋亡抑制基因bcl-2、PCNA mRNA的表达,从而诱骨肉瘤细胞发生凋亡。
结论:鬼臼毒素衍生物ZM的结构是实验室首次合成,并通过实验室体外实验,证明了其具有显著的体外抑制多种人源性肿瘤细胞生长的特性,对骨肉瘤细胞抑制作用也同样显著。根据实验结果推断,其通过诱导骨肉瘤细胞凋亡而减少细胞增殖,其机制可能是通过上调bax、P53、P21、caspase-3基因mRNA水平的表达量,下调bcl-2、PCNA基因mRNA水平的表达量而达到影响肿瘤细胞的增殖与诱导凋亡的作用。