论文部分内容阅读
单克隆抗体是针对肿瘤细胞表面特异性抗原的免疫治疗药物，其特异性强，毒副作用小，与化疗药物联合应用有协同治疗效应的优势。现已有数种治疗肿瘤的单克抗体在临床上应用，如美罗华(rituximab)治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，赫赛汀(Herceptin)治疗HER2阳性的乳腺癌，爱必妥(Cetuximab)治疗结肠癌，取得了良好的治疗效应，同时一些新的单克隆抗体正逐步被开发出来，已开始应用在基础实验研究甚至临床前期试验。所有的这些都为单克隆抗体治疗肿瘤的临床应用展现出美好的前景。但不幸的是原发的耐药或继发性的耐药不可避免的发生了。如何克服这些耐药问题已成为摆在人们面前的挑战之一。单克隆抗体治疗肿瘤的机制主要为CDC(complementdependent cytotoxicity补体依赖性细胞毒性作用)，ADCC(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)和直接凋亡(apoptosis)作用，以及利用信号传导抑制肿瘤细胞的生长。其中补体依赖性细胞毒性作用(CDC)是单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的主要作用机制之一。而影响补体激活效应的补体抑制蛋白在大多数肿瘤细胞组织中呈现高表达，其中又以抑制补体激活终末产物MAC(膜攻击复合物membrane attack complex)形成的CD59最为重要。利用抗体，siRNA，多肽等多种方法干扰CD59的产生和废除其功能，有效增强了抗体介导的补体杀伤肿瘤效应。但因CD59抗原同样表达在人体正常的组织细胞，所以这些方法可对正常人体细胞产生损伤，且应用效率较差，限制了其在临床上的应用价值。ILY毒素(intermedilysin)是一种由革兰氏阳性的病原菌中间型葡萄球菌S.intermedius分泌出来细胞穿孔毒素，其第四个功能部可特异性的与人类CD59抗原结合。哈佛医学院Translational Research Lab实验室用基因工程技术构建了含ILYd4基因片段的质粒，本课题就是利用这个质粒载体转化入感受态的BL2大肠杆细胞，表达纯化重组的ILYd4蛋白，并鉴定其纯度及生物学活性。然后观察其在改善抗CD20抗原的单克隆抗体Rituximab介导的对人类小囊泡淋巴细胞瘤细胞系RL-7，诱导耐药的人类伯基特淋巴瘤细胞系RR51.2及药物抵抗的多发性骨髓瘤细胞系ARH-77的补体杀伤效应中的作用。我们还将从小鼠腹腔中提取外周巨噬细胞观察重组ILYd4蛋白是否有助于其介导的ADCC效应。这些实验也在实体瘤骨肉瘤的SAOS2细胞系中进行。另外，我们也观察在耐药的RR51.2细胞载瘤裸鼠体内rILYd4蛋白是否可有效的改善rituximab的治疗效应。
第一部分重组ILYd4蛋白的表达，提取，纯化和生物活性鉴定
背景：ILY(intermedilysin)是一种穿孔毒素，它特异性结合人类CD59抗原，结合位点是其第四个功能部。如何能利用它特异性结合人类CD59抗原的功能，而去除其穿孔毒性的特性，制造出有效结合CD59抗原而无毒性的特异性蛋白。哈佛医学院Translational Research Lab实验室利用基因工程技术构建了含ILYd4基因序列的质粒载体。我们利用它来表达重组的ILYd4蛋白，并鉴定它的生物学活性，看它是否能有效的结合人类CD59抗原并表达一定的生物学活性。
方法：含ILYd4基因序列的质粒，转化入感受态的BL2大肠杆菌细胞，扩增，表达重组的ILYd4蛋白。His-binding技术纯化蛋白。SDS-PAGE鉴定其纯度及分子量。FACS分析其能否有效的结合人类红细胞的CD59抗原。溶血试验鉴定其生物学活性。同法提取含部分ILYd4基因的重组ILY3蛋白，研究是否同样有生物学活性。
结论：利用基因工程技术可成功的表达，提取，纯化重组的ILYd4蛋白，其具有较好的纯度及良好的结合人类CD59抗原废除其功能的生物学活性。
第二部分：重组ILYd4蛋白改善Rituximab对人类小囊泡淋巴瘤细胞系RL-7，诱导耐药的人类伯基特淋巴瘤细胞系RR51.2及多发性骨髓瘤ARH-77细胞系的免疫治疗作用的实验。
背景：Rituximab是一种特异性的结合人类CD20抗原的单克隆抗体。其已在临床治疗上得到有效的应用，但不可避免的产生原发的或继发的耐药。研究表明CD59抗原高表达，是限制单克隆抗体介导的补体依赖性细胞毒性的主要因素之一。废除CD59功能，从而增强Rituximab的治疗效应是当前研究的重要课题。我们提取纯化了重组ILYd4蛋白，它可有效的结合人类的CD59抗原，且具有良好的生物学活性。我们尝试利用rILYd4蛋白结合人类小囊泡淋巴瘤细胞系RL-7，诱导耐药的人类伯基特淋巴瘤细胞系RR51.2及耐药的多发性骨髓瘤细胞ARH-77上的CD59抗原。观察是否有利于增强rituxiamb的治疗效果及逆转细胞的耐药性。
方法：对敏感的人类伯基特淋巴瘤OR细胞(Ramos cells)给予逐渐加量的rituximab及10％正常成人血浆诱导，逐渐生成对rituximab抵抗的RR51.2细胞系。FACS分析检测其表面mCRPs(membrane complement regulated proteins膜补体调节蛋白)及CD20的表达，Western blot检测CD59蛋白质量，RT-PCR检测CD59的mRNA的表达水平。CDC效应试验比较它们对rituximab的敏感性。在rituximab介导的对RL-7，RR51.2和ARH-77细胞的CDC效应试验中逐渐增加rILYd4的用量，来观察其增强rituximab作用效果的情况。同样用饱和剂量的rILYd4去中和这些细胞表面的CD59抗原后，观察其耐药性的逆转情况。从小鼠的腹腔中提取了外周的巨噬细胞，检测rILYd4及rituximab在巨噬细胞介导的ADCC效应中的作用。分析不同细胞系的CD20和mCRPs的表达和rituximab，rILYd4的用量。观察在有效的rituximab治疗的情况下，rILYd4的IC50(50％细胞死亡时的剂量)及其和CD59表达量的关系。同时进行了rILYd4的肿瘤细胞毒性试验。
结论：Rituximab诱导的淋巴细胞耐药是筛选了CD59高表达的细胞亚群。rILYd4通过增强CDC效应来致敏淋巴瘤细胞系RL-7和RR51.2以及ARH-77细胞系并逆转其耐药性，而这和肿瘤细胞的CD59表达量有关系。rILYd4蛋白本身并无细胞毒性效应。
第三部分：重组ILYd4蛋白在体外致敏抗CD24单克隆抗体介导的抗骨肉瘤细胞系SAOS2的CDC效应的试验。
背景：我们已经证实了重组ILYd4蛋白通过结合肿瘤细胞表面的CD59抗原，增强了rituximab在血液系统肿瘤治疗中介导的CDC效应。同样CD59抗原的高表达，也是实体瘤抵抗单克隆抗体治疗的因素之一。实体瘤骨肉瘤细胞系SAOS2有高的CD59和CD24表达，抗CD24单克隆抗体SN3可有效的激活补体系统。我们观察重组ILYd4蛋白可否有效的提高抗CD24单克隆抗体在SAOS2细胞中的治疗效应。
方法：我们用Trypan blue和Alarma blue法来检测rILYd4在提高抗CD24单克隆抗体(SN3)治疗SAOS2细胞系中的效应以及当饱和剂量的rILYd4中和情况下，SAOS2细胞的致敏情况。外周巨噬细胞介导的ADCC效应也同时被检测。
第四部分：重组ILYd4蛋白增强Rituximab对RR51.2耐药淋巴瘤的载瘤裸鼠治疗效应试验
背景：在体外我们已经证实了重组ILYd4蛋白可有效的提高单克隆抗体治疗耐药肿瘤细胞系的效果。但其在体内的效果仍然未被证实。为了验证其在载瘤动物体内的治疗效果，我们将联合应用rituximab和rILYd4对RR51.2耐药淋巴瘤的载瘤裸鼠进行治疗，了解rituximab和rILYd4的联合治疗效应。
方法：培养RR51.2诱导耐药的淋巴瘤细胞系，浓缩后接种于裸鼠背部。接种成功后，载瘤裸鼠分成五个不同的治疗组。PBS空白对照组，单独rILYd4注射组，Rituximab单独注射组，Rituximab+rILYd4×3天注射组，Rituximab+rILYd4×12天注射组.Rituximab腹腔内注射10mg/kg，连续三日，rILYd42mg/kg腹腔注射连续3日或12天。每周测量肿瘤的体积大小，观察肿瘤生长变化情况。
结论：重组ILYd4蛋白可有效的提高rituximab治疗耐药RR51.2载瘤裸鼠的治疗效果。在体内重组ILYd4蛋白同样可以逆转RR51.2细胞的耐药性，为其作为单克隆抗体治疗肿瘤的辅助用药奠定了试验基础。