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水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一,同时已成为单子叶植物基因组学遗传和功能研究的模式植物。GAST(Gibberellic Acid-stimulated transcript)家族基因是一类受赤霉素(GA)诱导表达基因,在许多植物中被发现报道。水稻GAST-like同源基因有9个,有关其家族基因成员的功能报道甚少。因此,开展水稻GAST-like家族同源基因成员的功能研究,为阐明水稻在生长、发育过程中的作用机制有重要意义。
本论文重点研究水稻4个GAST-like同源基因,分别命名为OsGASR1(GibberellicAcid Stimulated in Rice)、OsGASR2、OsGASR3和OsGASR4。通过半定量RT-PCR研究它们的时空表达模式和激素处理对表达的影响,并通过农杆菌介导法获得相关的水稻RNAi转化株系,初步完成了4个OsGASRs基因的功能分析,得到以下结果:
1、初步测定了OsGASR1、OsGASR2、OsGASR3、OsGASR4在不同组织器官的时空表达模式。OsGASR1和OsGASR2在幼苗期的根、茎节和叶中均有表达,进入生殖生长期后主要在孕穗期的幼穗(颖花和花梗)和成熟的颖花中表达。OsGASR3在幼苗期主要在不定根、叶芽和茎节中表达,而孕穗期和抽穗期主要在颖花中表达。OsGASR4在3d-6d幼苗的叶芽、茎节和幼根以及14d的茎节中表达,同时也在孕穗期和抽穗期的颖花中大量表达。OsGASR1和OsGASR4在成熟的叶鞘中有微量表达。4个OsGASRs基因都不在成熟的旗叶中表达。4个OsGASRs在孕穗期至完熟期的茎节间中表达有一定特异性:OsGASR1、OsGASR2和OsGASR3主要在孕穗期的第Ⅰ节间(穗颈节间)和第Ⅱ节间表达；OsGASR4在孕穗期至完熟期的第Ⅰ节间(穗颈节间)和第Ⅱ节间中都有表达。
2、OsGASR1对外源赤霉素(GA3)不敏感,OsGASR2和OsGASR4在野生型和d-18幼苗中受GA抑制,但OsGASR3受外源GA3的促进表达。在野生型幼苗中OsGASR1、OsGASR2和OsGASR4受表油菜素内酯(eBL)的抑制,而OsGASR3对eBL不敏感；在d-18突变体幼苗中OsGASR3的表达水平显著低于野生型,外加eBL后表达量上调。OsGASR1、OsGASR2和OsGASR4在d-18突变体颖花中的表达受到GA3促进,但在野生型水稻颖花中受到GA3显著抑制。OsGASR3在野生型颖花中对外源GA3不敏感；但OsGASR3在d-18突变体颖花中表达受到GA3抑制。
3、构建RNA干涉表达载体OsGASRs-pRNAi。农杆菌介导水稻遗传转化得到OsGASR3-RNAi转基因植株50株,转化率为6.4％,得到OsGASR4-RNAi转基因植株32株,转化率为4.4％。通过Southern Blot鉴定了T0转基因植株的基因拷贝数。
4、RT-PCR检测结果表明,T1代转基因干涉株系3-2、3-4、3-7的目的基因OsGASR3表达量有所降低,同时抑制了同源基因OsGASR2、OsGASR4的表达量；T1代转基因干涉株系4-1、4-4、4-25敲除了目的基因OsGASR4的表达,同时也使OsGASR1表达量下调,对OsGASR2的表达基本没有影响,而对OsGASR3的表达则有轻微上调作用。
5、对T1代转基因水稻进行了初步的表型分析。OsGASR3-RNAi和OsGASR4-RNAi植株T1代种子的萌发率都比野生型降低。野生型种子萌发率接近100％,而株系3-4、3-15、3-25、4-1、4-29的萌发率在50％-65％之间,株系3-2、3-7、4-25的萌发率低于50％。OsGASR3-RNAi和OsGASR4-RNAi植株幼苗(10d龄)与野生型相比表现出矮化,平均苗长比野生型缩短约54％；转基因幼苗(10d龄)不定根的数量和长度也比野生型水稻明显减少,6个OsGASR3-RNAi株系不定根平均根长比野生型减少26.7％,平均根数减少32.9％；4个OsGASR4-RNAi株系不定根平均根长比野生型减少41.2％,平均根数减少36.5％。