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造血发生是机体血液中细胞组分形成的过程。这些细胞由造血干细胞增殖和分化而来。由此，造血发生维持了整个机体血液循环系统的稳定。在成体中，造血干细胞存在于骨髓，通过增殖产生子代造血干细胞以维持数量稳定。同时，非对称分裂产生的子代细胞不断分化，最终成为成熟的血细胞。然而，胚胎发育过程中造血干细胞是怎样产生、维持以及起始分化的仍然不甚了解。迄今为止，多种模式生物的研究都支持胚胎发育过程中造血干细胞出现于主动脉-性腺-中肾区，但是并不能直接证明造血干细胞产生于此而不是由别处产生后迁移而来。这种对造血干细胞产生的有限了解局限了造血干细胞相关机制研究，阻碍了造血干细胞在医学上的运用。 为了研究个体发生过程中造血干细胞是怎样产生的，细胞命运图谱的绘制至关重要。当前在体内细胞分离，器官培养和体外分化等技术的进步产生了大量更加精确和深入的数据，推动了传统造血干细胞相关认知的改进。传统的谱系追踪方式包括染料染色以及荧光蛋白标记等方法，但是上述方式都不能保持细胞在自然条件下去研究其增殖与分化过程，从而正确认识造血发生的命运图谱。与当前使用的“条形码”、“彩虹蛋白”等技术不同，本课题将荧光蛋白序列精确整合进入lkzf1基因座，既保持了Ikzf1基因的野生型状态又追踪了该基因表达产物的空间和时间分布。Ikzf1作为造血相关转录因子，既是造血干细胞造血能力的决定性因子之一，又决定了造血干细胞向淋巴系细胞的分化能力。其表达的Ikaros蛋白在造血干细胞产生过程中起始表达，并且在造血干细胞中维持高表达状态。小鼠El4天胚胎的原位杂交数据表明，该蛋白只表达于造血相关组织中，具有很强特异性。由此，Ikzf1作为造血干细胞产生与维持的细胞内标记对象十分理想。借助p2A序列在蛋白水平被特异性切断的特点，eGFP荧光蛋白与Ikzf1序列相结合，在蛋白水平相互分离。因此，这样的设计既保证了Ikzf1基因正常表达，又通过绿色荧光蛋白的表达水平模拟了Ikaros蛋白的产生水平，从而在体内研究个体发生过程中造血干细胞的产生、维持与分化。 近年来，CRISPR/Cas9技术的产生和发展大大简化了大片段DNA同源重组技术在基因组遗传修饰中的运用。本课题即借助CRISPR/Cas9系统，将绿色荧光蛋白序列通过同源重组机制精确而高效的整合进入Ikzf1基因座中，获得了具有正常胚胎于细胞状态的Ikzf1-eGFP胚胎干细胞系。 采用px330质粒可以在细胞内同时表达gRNA和Cas9蛋白。首先，不同的gRNA对序列的识别特异性不同，因此需要选择高效识别的gRNA序列。电转染的方式将包含不同gRNA序列的px330质粒转化进入小鼠胚胎干细胞中，测序结果显示出在gRNA识别位点的突变情况，从而分析出该gRNA的效率。高效的gRNA被采用。高效的px330质粒与同源重组模版质粒同时电转化进入小鼠胚胎干细胞中，借助药筛基因，成功同源重组的胚胎干细胞克隆被筛选出来。 体外分化过程中，小鼠胚胎干细胞和OP9细胞进行了共培养9天后小鼠胚胎干细胞就达到了造血干祖细胞，或者具有造血潜能的细胞状态。流式分析表明，获得的造血干/祖细胞中绿色荧光蛋白能够正常表达，且相对于表面标记识别造血干/祖细胞数量更加稀少和特异。 综上所述，本课题构建了新型的Ikzf1荧光标记系统，既保持了Ikzf1基因座位的完整，又保证了基因组的正常状态。体外分化表明，一群Ikzf1+，Sca-1hi细胞用本课题构建的细胞系从传统的造血干祖细胞群中识别出来。