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与其它脊椎动物一样，鱼类胚胎发育亦产生体细胞系(somatic lineage)和生殖细胞系(germline)两大类细胞谱系。生殖细胞系在胚胎发育的早期就与体细胞系分离，其标志是原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的形成，PGCs经过迁移到达性原基，与体细胞相互作用形成性腺，随后经过一系列的分化发育过程形成成熟的两性生殖细胞——精子和卵子，以此来保持物种遗传信息的延续。从PGCs的形成到成熟的两性配子的产生，是需要多种基因和各种组分参与的复杂过程，任何一个阶段或步骤发生变化都可能给生物体的繁殖能力带来巨大的影响。其中，dead end(dnd)基因是脊椎动物生殖质的特有组分，对PGCs迁移和存活至关重要;piwi基因能调控生殖干细胞的增殖和分裂，在生殖干细胞的维系方面起重要作用。 目前，受人类活动的影响，鲟鱼的资源状况已明显衰退，处于不同程度的濒危状态。然而，由于鲟鱼自身繁殖生物学的特征，导致其资源量的恢复过程极为缓慢。近年来，鱼类生殖细胞的研究进展迅猛，随着生殖细胞标记、分离、体外培养和移植技术的建立，濒危物种种质资源的冷冻保存、借助近缘物种进行代理繁殖已在多种鱼类中得以成功应用。借助代理亲鱼技术缩短其繁殖周期为鲟鱼的物种保护提供了新的思路和方法。但是，有关鲟鱼生殖细胞方面的研究还比较少，许多工作亟待开展，本研究以中华鲟和达氏鲟为研究对象，围绕与生殖细胞发生发育密切相关的dnd和piwi基因展开，主要取得了以下研究结果: 1.中华鲟、达氏鲟dnd基因的克隆和表达特征 利用基因同源克隆和RACE手段，分别从中华鲟和达氏鲟卵巢的SMART cDNA库中分离鉴定出了dead end(dnd)的同源基因，即Asdnd和Addnd。Asdnd cDNA序列全长1630bp，包括64 bp5非编码区(untranslated regions，UTR)，编码396个氨基酸的1191 bp开放阅读框（open reading frame，ORF）和3UTR375bp。AdDnd与AsDnd氨基酸序列一致性高达98.99％;通过氨基酸序列的多重对比发现，鲟鱼Dnd与其它物种的Dnd一样，具有包括RNA识别域在内的6个保守结构域;系统进化分析表明，鲟鱼Dnd属于硬骨鱼类分支。RT-PCR研究结果显示，鲟鱼dnd mRNA为母源表达，且仅在两性性腺组织中表达，随卵巢的发育其表达量呈逐渐升高的趋势，在Ⅳ期卵巢中的表达量最高;在精巢中，Addnd mRNA的表达量在Ⅱ期精巢中最高。荧光原位杂交研究发现，鲟鱼dnd mRNA仅在生殖细胞中特异表达，在卵巢中，dndmRNA在卵原细胞中的信号较弱，并随卵母细胞的发育逐渐加强，在精巢中，dndmRNA则在精原细胞中表达最强，在精子发育的后期表达量逐渐减弱。 2.达氏鲟dnd基因的功能研究 为了研究达氏鲟dnd基因3 UTR定位PGCs的功能及其保守性，首先我们分析了达氏鲟dnd3UTR的序列特征，发现其3UTR具有miR-430的结合位点(GCACTTT);随后，构建了融合Addnd3UTR序列和绿色(GFP)或红色荧光蛋白（RFP）的编码区序列的GFP/RFP-dnd3UTR重组表达载体;将该载体体外逆转录为mRNA并显微注射到达氏鲟受精卵。结果表明，达氏鲟dnd3UTR可以定位并追踪PGCs;此外，还发现鲟鱼的dnd3 UTR可以标记斑马鱼的PGCs，表明鱼类dnd3UTR标记PGCs的功能具有一定的保守性，且其在PGCs中稳定表达的机制可能与microRNA的调节有关。最后，我们合成了达氏鲟dnd Morpholino（dnd-MO），消减dnd基因的表达，结果发现注射了dnd-MO的达氏鲟胚胎PGCs信号缺失或者减少，表明PGCs的形成或迁移受到抑制，这为利用基因消减技术获得生殖细胞缺失的受体鲟鱼及为代理亲鱼技术在鲟鱼中的应用奠定了重要基础。 3.中华鲟、达氏鲟piwi基因的分离鉴定和表达特征 通过对中华鲟、达氏鲟piwi基因的克隆，发现鲟鱼中存在piwi-like1和piwi-like2两个Piwi亚家族的同源基因，分别为Aspiwil1、Adpiwil1和Aspiwil2、Adpiwil2，其中，Aspiwil1和Adpiwil1的cDNA序列长3393bp和3351bp，开放阅读框均为2583bp，编码860个氨基酸，Aspiwil2和Adpiwil2 cDNA序列长分别为3850bp和3643bp，分别编码1095和1055个氨基酸。通过氨基酸的多重对比，发现鲟鱼Piwil1和Piwil2均具有PAZ和PIWI这两个典型的保守结构域;系统进化分析显示，鲟鱼Piwil1和Piwil2分别聚到Piwil1和Piwil2分支。半定量RT-PCR表明，Adpiwil1和Adpiwil2均为母源表达;qRT-PCR研究发现，Adpiwil1除在两性性腺组织中有表达外，还在脑组织中有少量表达，Adpiwil2则仅在性腺组织中表达，此外，还分析了Adpiwil1和Adpiwil2在达氏鲟不同性腺发育时期的表达特征。性腺切片荧光原位杂交显示，Adpiwil1和Adpiwil2均仅在生殖细胞中特异表达;制备了鲟鱼Piwil1和Piwil2的多克隆抗体，免疫组化表明，Piwil1在生殖细胞的细胞质中表达，Piwil2则在生殖细胞的细胞核中表达;构建了鲟鱼GFP-piwil13UTR的表达载体，通过显微注射表明，鲟鱼piwil13UTR可以定位于斑马鱼的脑和眼中，不能定位斑马鱼PGCs。 4.雌二醇抑制鲟鱼piwi基因的表达 利用体内注射和体外培养的方法研究了雌二醇(E2)对达氏鲟piwi基因的表达调控作用。在注射了剂量为5mg/kg的E2后，达氏鲟卵巢组织中Adpiwil1和Adpiwil2mRNA的表达量相对于仅注射了生理盐水的对照组来说明显下调。此外，我们又对达氏鲟卵巢组织细胞进行了原代培养，并对其实施了不同浓度的E2处理，结果发现，10-8M、10-6M、10-4M三个处理浓度均可以使Adpiwil1的表达量降低，但是并没有明显的变化趋势，似乎10-6M的处理浓度对Adpiwil1基因表达量的抑制作用较为明显，与Adpiwil1不同的是，Adpiwil2基因的表达量随着E2处理浓度的升高而降低，10-4ME2处理浓度对Adpiwil2基因表达量的抑制作用更为显著。上述结果为研究下丘脑-垂体-性腺轴(brain-pituitary-gonad，BPG)与Piwi-piRNA信号通路之间的调控关系及piwi基因在低等脊椎动物卵巢发育及卵子发生中的功能提供了基础。