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目的骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一种以骨强度下降,骨微观结构改变和骨脆性增加为特征的慢性全身性骨骼系统疾病,是生理衰老在骨骼方面的一种特殊表现。随着我国社会老龄化进程的加快和我国平均寿命的延长,OP的发病率不断上升,预计到2020年我国将成为世界上拥有OP患者最多的国家,因此,寻求其发病机理和安全有效的防治药物显得尤为重要。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓的一类多潜能成体干细胞,其向成骨细胞(Osteoblasts,OB)分化能力下降是造成OB生成不足,骨形成降低,发生OP的主要病机之一。中医学认为“肾藏精,主骨,生髓”,即骨髓由肾精所化生,肾精充足,骨髓生化有源,骨骼得养,则骨骼生长发育正常,强健有力,若肾精亏虚,则骨髓生化乏源,不能充养骨骼则致骨髓空虚,发为OP,这一理论与现代医学BMSCs向成骨分化能力下降造成OP的发生极其相似,因此,现代医学认为BMSCs可能是肾精在细胞水平上的表现形式,并多从补肾中药入手,寻找能够促进BMSCs的增殖及诱导其向成骨分化的有效药物,以促进骨的形成,延缓OP的发生。梓醇是传统补肾滋阴中药地黄的有效活性成分,研究表明,其对神经系统疾病,糖尿病、心血管疾病,骨质疏松等多种疾病均体现出一定的防治作用。本研究观察梓醇对BMSCs增殖、骨向分化的影响,以及观察它对分化相关的Hedgehog信号通路的影响,明确梓醇作用于BMSCs而影响防治OP的具体靶点,从一条新途径阐明梓醇对OP的调节机制,对评价梓醇防治OP的有效性提供细胞分子学依据,另一方面丰富中医学理论“肾藏精,主骨,生髓”理论的现代科学内涵,也为中医养生本草的现代研究提供实验依据。方法1.采用全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs;2.通过倒置显微观察BMSCs形态学特性、电子显微镜观察BMSCs微观结构,CCK-8法检测BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs的细胞周期及细胞表面标志分子CD29、CD90、CD45、CD80,ALP染色和茜素红染色鉴定其成骨分化特性,油红O染色鉴定其成脂特性;3.CCK-8方法检测不同浓度梓醇(1×10T3mol/L～1×10-9mol/L)对BMSCs的增殖活性的影响;4.pNPP法检测不同浓度梓醇(1×10-3mol/L～1 ×10-9mol/L)对BMSCs碱性磷酸酶活性的影响,以确定梓醇最佳的促BMSCs骨向分化浓度;5.以最佳促骨向分化浓度的梓醇对BMSCs进行干预,实验分四组:对照组(control group):BMSCs细胞以含15%胎牛血清的α-MEM完全培养液培养;梓醇组(catalpol group):含15%胎牛血清的α-MEM完全培养液培养的BMSCs细胞中加入最佳浓度的梓醇;经典组(classic group):BMSCs细胞中加含15%胎牛血清的成骨诱导液;联合组(combination group):BMSCs细胞中加含15%胎牛血清的成骨诱导液+梓醇最佳作用浓度。6.ALP试剂盒检测各实验组对BMSCs ALP活性的影响,茜素红染色计数矿化结节的方法评价梓醇对BMSCs细胞矿化的影响,ELISA法检测梓醇对BMSCs BGP的影响;7.QPCR技术检测各实验组干预BMSCs骨向分化过程中Hedgehog信号分子Shh、IhhmRNA 的表达;8.Western blotting技术检测各实验组干预BMSCs骨向分化过程中Hedgehog信号传导通路中跨膜受体Ptch1、Smo蛋白的表达和下游核转录因子Gli1蛋白的表达。结果1.分离培养的细胞符合BMSCs的生物学特性,流式细胞仪检测大鼠BMSCs表面标志抗原CD90、CD29表达阳性,CD45及CD80表达阴性,BMSCs经诱导能向成骨细胞、脂肪细胞分化。2.CCK-8方法检测结果显示:细胞培养第1、3、5 d,1×10-3mol/L～1×10-9mol/L浓度范围的梓醇组OD值与空白组比较均有显著升高(P<0.05);第7 d,1×10-4mol/L～1×10-9 mol/L梓醇组OD值与空白组比较均有显著升高(P<0.05),而1×10-3mol/L梓醇组OD值与空白组无显著性差异(P>0.05);第9 d,1 ×10mol/L～1 ×10-9 mol/L梓醇组OD值与空白组比较均有显著升高(P<0.05),而1×10-3mol/L、1×10-4mol/L梓醇组OD值与空白组比较无显著性差异(P>0.05);第 11 d,1×10-5mol/L 和 1×10-6mol/L 的梓醇组 OD 值与空白组比较显著升高(P<0.05),其它各浓度梓醇组OD值无显著性差异(P>0.05)。3.pNPP法检测结果显示:第3、18、21 d,不同浓度的梓醇组的ALP活性与空白组相比均无显著性差异(P>0.05);第6 d,1×10-4mol/L浓度的梓醇与空白组相比能显著提高 BMSCs ALP 活性(P<0.05);第 9 d,1 × 1 0-3mol/L～1 × 1 0-5mol/L浓度的梓醇与空白组相比能显著提高BMSCs ALP活性(P<0.05);第 12、15 d,1×10-3mol/L、1×10-4mo1/L 浓度的梓醇与空白组相比均能显著提高BMSCs ALP活性(P<0.05),且以1×10-4mol/L作用最显著,故以1×10-4 mol/L的梓醇浓度为后续实验的最佳给药剂量。4.ALP试剂盒检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的ALP活性与对照组比较均显著升高(P<0.05),但梓醇组的ALP活性低于经典组(P<0.05),联合组的ALP活性与经典组比较均无显著差异(P>0.05)。5.茜素红染色计数结果显示:梓醇组、经典组和联合组的矿化结节数量与对照组比较显著升高(P<0.05),但梓醇组的ALP矿化结节数量低于经典组(P<0.05),联合组的矿化结节数量与经典组比较无显著差异(P>0.05)。6.ELISA法检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的BGP含量与对照组比较显著升高(P<0.05),但梓醇组的BGP含量低于经典组(P<0.05),联合组的BGP含量与经典组比较无显著差异(P>0.05)。7.QPCR检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的Shh mRNA表达与对照组比较显著升高(P<0.05),梓醇组的Shh mRNA表达低于经典组(P<0.05),联合组与经典组的Shh mRNA表达无显著差异(P>0.05);梓醇组、经典组和联合组的Ihh mRNA表达与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。8.Western blotting检测结果显示:梓醇组、经典组和联合组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达与对照组比较显著升高(P<0.05);梓醇组和联合组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达均低于经典组(P<0.05);梓醇组的Ptch1、Smo和Gli1蛋白表达与联合组无显著性差异(P>0.05)。结论1.采用全骨髓贴壁法可获得增殖能力强,纯度高的BMSCs;2.不同浓度的梓醇对BMSCs的增殖具有明显的促进作用;3.一定浓度范围(1 ×10-3～1 ×10-5mol/L)的梓醇可以诱导BMSCs向成骨分化,尤以1 × 10-4mol/L作用明显,并能提高BMSCs ALP活性、矿化结节数目和BGP的含量;4.梓醇促BMSCs的骨向分化过程中Hedgehog信号传导通路上游Ihh信号分子可能不参与调控;5.梓醇可通过上调Hedgehog信号传导通路中上游Shh信号分子、膜受体Ptch1、Smo和核转录因子Gli1来促进BMSCs的骨向分化,从而防治OP。