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胰岛素抵抗(insulin resistence，IR)作为2型糖尿病的主要病理生理基础，是糖尿病发生心血管并发症的重要危险因子。因此治疗胰岛素抵抗，减少心血管事件的发生对糖尿病患者有着重要意义。
脂联素(adiponectin，APN)是近年来发现的由脂肪细胞特异性分泌的细胞因子，其与脂联素受体结合后，能够改善胰岛素的敏感性，具有拮抗胰岛素抵抗、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用。目前，脂联素已被研究者们推荐为代表胰岛素抵抗的一个值得信赖的标记物。脂联素表达水平越低，胰岛素抵抗越严重。
盐皮质激素醛固酮在糖尿病领域的相关研究甚少。有研究显示，原发性醛固酮增多症患者具有较低的葡萄糖利用率和胰岛素敏感指数，即存在胰岛素抵抗。肾上腺皮质腺瘤患者术后，随着血浆醛固酮水平的下降，其胰岛素敏感指数增加，胰岛素抵抗状态得到改善。临床试验证实拮抗醛固酮受体可增加糖尿病肾病患者血浆脂联素水平。应用醛固酮刺激心肌成纤维细胞后发现丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)活性增加，应用螺内酯后则抑制MAPK活性。
脂联素信号通路和胰岛素信号通路、醛固酮诱导胰岛素抵抗分子机制之间存在交叉。脂联素与其受体结合后，通过MAPK途径中的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号转导途径引起下游一系列分子的改变，使过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)磷酸化[2]，从而达到增加脂肪酸的β氧化、改善IR等生物学作用。近期有学者发现，拮抗醛固酮受体后，糖尿病大鼠脂肪组织表达脂联素、PPARγ增加，提示PPARγ可能参与了醛固酮的胰岛素抵抗作用。PPARα、PPARγ都是PPARs的亚型，PPARγ主要在脂肪组织表达，PPARα主要在肝脏、心脏中表达，两者在胰岛素抵抗中都起到重要作用。但上述研究均集中在脂肪组织、肝脏和骨骼肌组织，对心肌细胞的相关研究甚少。
近期有学者发现大鼠心肌细胞亦表达脂联素[9]，故我们假设心肌细胞可能通过自分泌、旁分泌脂联素来改善局部胰岛素抵抗，而拮抗醛固酮受体是否可能会通过P38MAPK信号转导途径激活PPARα，上调脂联素的表达、改善心肌细胞局部胰岛素抵抗，目前国内外尚无相关报道。
本研究拟从体外培养细胞和动物实验2个水平，分4个部分研究心肌细胞胰岛素抵抗与心肌细胞脂联素表达的关系，首次建立了胰岛素抵抗心肌细胞模型，进一步探讨了醛固酮受体拮抗剂螺内酯对心肌细胞脂联素表达的影响，并对其分子机制进行初步研究，为临床治疗糖尿病胰岛素抵抗，降低胰岛素抵抗的心肌损害，提供重要的理论和实践依据。本研究主要包括以下四部分：
第一部分葡萄糖、胰岛素对乳鼠心肌细胞脂联素表达的影响
目的：观察心肌细胞是否表达脂联素；运用RT-PCR、Western-Blot技术，观察不同浓度葡萄糖刺激下，心肌细胞脂联素表达的变化；观察高浓度葡萄糖刺激下心肌细胞脂联素表达的变化是否由高渗透压状态造成；观察不同浓度胰岛素刺激下，心肌细胞脂联素表达的变化。
方法：原代培养2～3天SD大鼠心肌细胞，分组如下：①葡萄糖干预高渗组(hypertonic，与50mmol/L组渗透压相等，并与5.5mmol/L组葡萄糖浓度相等，用以排除渗透压变化对于心肌细胞脂联素表达的影响)、5.5mmol/L组、20mmol/L组、25mmol/L组、30mmol/L组、50mmol/L组；②胰岛素干预0mol/L组、10-10mol/L组、10-9mol/L组、10-8mol/L组、10-7mol/L组、10-6mol/L组。应用RT-PCR、Western-Blot技术观察各组心肌细胞脂联素表达变化。
结果：
1 在葡萄糖浓度小于30mmol/L组中，心肌细胞APN mRNA和蛋白表达随葡萄糖浓度的增加而减低（P＜0.05）。30mmol/L组和50mmol/L组比较，APN mRNA和蛋白表达无显著差异（mRNA:0.31±0.05 vs0.30±0.04，P＞0.05;蛋白：4.47±0.28 vs4.42±0.31，P＞0.05）。高渗组与相同葡萄糖浓度的5.5mmol/L组比较APN mRNA和蛋白表达无显著性差异（mRNA:1.07±0.03 vs1.06±0.02，P＞0.05；蛋白：5.49±0.15 vs5.54±0.13，P＞0.05）。
2 在胰岛素浓度小于10-7mmol/L组中，心肌细胞APNmRNA和蛋白表达随胰岛素浓度的增加而减低（P＜0.05）。10-7mmol/L组和106mmol/L组比较，APN mRNA和蛋白表达无显著差异(mRNA:0.17±0.02 vs0.17±0.01，P＞0.05;蛋白：7.16±0.01 vs7.11±0.01，P＞0.05）。
结论：心肌细胞能够表达脂联素；在一定范围内，心肌细胞脂联素表达随着葡萄糖浓度的增加而下降；高渗透压不是高浓度葡萄糖下调心肌细胞脂联素表达的原因；在一定范围内，心肌细胞脂联素表达随着胰岛素浓度的增加而下降。
第二部分胰岛素抵抗心肌细胞模型的建立与评价
目的：建立胰岛素抵抗心肌细胞模型。
方法：原代培养2～3天SD大鼠心肌细胞48h后，换为无血清的低糖DMEM培养基继续培养24h，同时进行分组，分为4组：①对照组(control):以低糖DMEM培养基培养24h。②葡萄糖组(G):以30mmol/L葡萄糖干预24h。③胰岛素组(Ins)：以10-7mmol/L胰岛素干预24h。④葡萄糖+胰岛素组(G+Ins)：以30mmol/L葡萄糖和10-7mmol/L胰岛素共同干预24h。在干预24h和48h后，分别应用3H-D-葡萄糖掺入实验评价细胞的胰岛素敏感性，并检测各组心肌细胞脂联素表达。
结果：
1 干预48h后，G组心肌细胞3H-D-葡萄糖掺入率(13.58±0.49)与对照组(14.06±0.43)比较无显著性差异，P＞0.05;Ins组心肌细胞3H-D-葡萄糖掺入率(12.46±1.11)较对照组显著下降，P＜0.05;G+Ins组心肌细胞3H-D葡萄糖掺入率(10.61±1.14)较对照组显著下降，P＜0.05。
2 干预48h后，G组(0.66±0.09)、Ins组(0.35±0.04)、G+Ins组(0.38±0.04)心肌细胞脂联素mRNA较对照组(0.77±0.08)均显著下降，P＜0.05。
3 对照组、G组、Ins组、G+Ins组3H-D-葡萄糖掺入率与心肌细胞脂联素mRNA表达量均呈显著正相关(r=0.92，r=0.82，r=0.89，r=0.86，P＜0.05)。
结论：应用高胰岛素诱导法、高葡萄糖+高胰岛素共同诱导法均可建立胰岛素抵抗心肌细胞模型；胰岛素抵抗下调心肌细胞脂联素表达水平；胰岛素抵抗心肌细胞脂联素表达水平与胰岛素抵抗呈正相关。
第三部分醛固酮受体拮抗剂螺内酯改善大鼠心肌胰岛素敏感性的相关研究
目的：观察螺内酯对胰岛素抵抗心肌细胞3H-D-葡萄糖掺入率以及脂联素、炎性因子表达的影响；观察螺内酯对2型糖尿病伴胰岛素抵抗大鼠心肌组织脂联素表达及血浆炎性因子表达的影响。
方法：
1 体外实验按前述高葡萄糖+胰岛素法诱导胰岛素抵抗心肌细胞进行培养24小时后，换为低糖培养基培养，分为4组：①对照组(G+Ins)：以低糖DMEM培养基培养24h。②螺内酯10-7mmol/L组(antisterone10-7):以10-7mmol/L螺内酯干预24h。③螺内酯106mmol/L组(antisterone106):以10-6mmol/L螺内酯干预24h。④螺内酯10-5mmol/L组(antisterone10-5):以10-5mmol/L螺内酯干预24h。检测3H-D-葡萄糖掺入率以及心肌细胞脂联素、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的表达变化。
2 动物实验体重160～180g的SD雄性大鼠分成三组：对照组(control)、高脂饮食组(high-fat diet)、螺内酯组(antisterone)。对照组饲以常规大鼠饲料8周，高脂饮食组和螺内酯组饲以高脂饲料8周。在高脂饮食喂养4周后，高脂饮食组和螺内酯组大鼠按35mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)一次，48小时后测定空腹血糖大于7.0mmol/L者继续进入实验程序。之后高脂饮食组除给予高脂饲料外再给予生理盐水40mg/kg·d灌胃4周；螺内酯组除给予高脂饲料外再给予螺内酯40mg/kg·d灌胃4周。之后检测各组大鼠心肌组织脂联素表达变化；稳态模式评估法(Homeostasis Model Assessment，HOMA)检测胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);抽空腹静脉血对血浆葡萄糖、胰岛素、脂联素、K+、IL-6、TNF-α进行检测。
结果：
1 antisterone10-7组(12.35±1.12)、antisterone10-6组(13.07±0.62)、antisterone10-5组(13.87±0.13)心肌细胞3H-D-葡萄糖掺入率与G+Ins组(10.61±1.14)比较均显著增加，P＜0.05。antisterone10-5组较antisterone10-6组和antisterone10-7组3H-D-葡萄糖掺入率显著增加，P＜0.05。
2 antisterone10-7组(0.76±0.77)、antisterone10-6组(0.95±0.14)、antisterone10-5组(1.28±0.22)心肌细胞脂联素表达量与G+Ins组(0.35±0.04)比较均显著增加，P＜0.05。antisterone10-6组较antisterone10-7组，antisterone10-5组较antisterone10-6组脂联素表达量均显著增加，P＜0.05。
3 antisterone10-7组心肌细胞TNFα、IL-6 mRNA表达量与G+Ins组比较无显著差异，P＞0.05; antisterone10-6组和antisterone10-5组TNFα、IL-6 mRNA表达量与G+Ins组比较均显著下降，P＜0.05。antisterone10-6组较antisterone10-7组TNFα、IL-6 mRNA表达量无显著差异，P＞0.05。antisterone10-5组较antisterone10-6组、antisterone10-7组TNFα、IL-6mRNA表达量显著降低，P＜0.05。
4 SD大鼠高脂饮食组HOMA-IR、TNF-α、IL-6与对照组比较显著增高（P＜0.05），而螺内酯组与高脂饮食组比较显著下降（P＜0.05）；高脂饮食组（1.01±0.06ug/ml）血浆脂联素水平较对照组(1.74±0.07ug/ml)显著下降(P＜0.05)，而螺内酯组(1.38±0.07ug/ml)与高脂饮食组比较显著升高（P＜0.05）。
5 高脂饮食组血钾较对照组、螺内酯组均无显著性差异（P＞0.05）。
结论：大鼠心肌脂联素表达越低，其胰岛素敏感性越低，炎性因子表达越高，胰岛素抵抗越明显。而醛固酮受体拮抗剂螺内酯可明显改善胰岛素抵抗心肌脂联素的表达，降低炎性因子水平，改善胰岛素敏感性。第四部分醛固酮受体拮抗剂上调心肌细胞脂联素表达的分子机制
目的：通过应用p38MAPK特异性抑制剂SB202190干预不同分组的胰岛素抵抗心肌细胞，观察PPARα及脂联素变化，进一步探究螺内酯增加心肌细胞脂联素表达的分子机制。
方法：按前述高葡萄糖+胰岛素诱导的胰岛素抵抗心肌细胞方法进行大鼠心肌细胞原代培养。分为4组：①G+Ins+antisterone组：以10-5mmol/L螺内酯干预24h。②G+Ins+antisterone+SB203580组：以10-5mmol/L螺内酯和20umol SB203580共同干预24h。③G+Ins组：继续以低糖培养基培养。④G+Ins+SB203580组：以20umol SB203580共同干预24h。之后检测心肌细胞脂联素及PPARα的表达变化。
结果：
1 G+Ins+SB203580组(0.79±0.07)脂联素mRNA表达量与G+Ins组(0.83±0.05)比较无显著性差异，P＞0.05; G+Ins+antisterone+SB203580组(0.83±0.06)脂联素mRNA表达量较G+Ins+antisterone组(0.88±0.05)显著性降低，P＜0.05。
2 G+Ins+SB203580组(0.45±0.03) PPARα mRNA表达量与G+Ins组(0.54±0.09)比较无显著性差异，P＞0.05；G+Ins+antisterone+SB203580组(0.66±0.10) PPARα表达量较G+Ins+antisterone组(0.74±0.06)显著降低，P＜0.05;G+Ins+antisterone组与G+Ins组比较PPARα表达量显著增加，P＜0.05。
结论：随着脂联素表达的下降，胰岛素抵抗心肌细胞PPARα表达也下降；醛固酮受体拮抗剂螺内酯在显著改善胰岛素抵抗心肌细胞脂联素表达的同时，能上调PPARα表达。这种变化可被P38MAPK特异性抑制剂SB203580所抑制。说明醛固酮受体拮抗剂改善胰岛素抵抗心肌细胞脂联素表达这一作用，与P38MAPK信号转导通路密切相关。