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美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)是世界性检疫害虫,原产北美。40年代末,随着人类活动和运载工具传播到欧洲和亚洲,1979年传入我国。目前,国内已有6个省市发现美国白蛾疫情。作为外来入侵昆虫,美国白蛾在中国缺乏有效的自然控制因子,危害极大。美国白蛾幼虫能取食200多种阔叶树叶片,还危害花卉、农作物、蔬菜等多种作物。在北方一年繁殖2~3代,食性杂、适应性强、繁殖量大、常爆发成灾。如果不及时防治,对林果业、农业及绿色植物都会造成直接危害,遭受重大经济损失。因此,开发美国白蛾防治技术研究极其重要,化学防治可以短期内控制美国白蛾的发生与危害,但应用生物防治才是控制其扩散、蔓延和为害的有效手段,能有效改善自然生态环境,减少化学农药的污染及害虫抗药性问题。美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)作为生物杀虫剂在其他国家已得到应用,对环境和人畜安全,不伤害天敌,能在自然界中引起病毒流行病达到长期控制害虫的目的。本文主要开展美国白蛾幼虫感染HycuNPV的组织病理变化,HycuNPV的致病机理,HycuNPV的毒力测定,HycuNPV基因组限制性内切酶图谱分析等研究。此外对HycuNPV的两个特有基因orf121、orf148进行了克隆与原核表达,建立了用PCR检测寄主有否感染HycuNPV的方法。
本文共分为四章。
第一章:综述。概述昆虫杆状病毒的分类、形态与结构特征,病毒的侵染机制、病毒的增殖及感染循环过程,病毒的基因组特征与功能及应用现状;其次是介绍美国白蛾的发生与危害,美国白蛾的防治现状及美国白蛾核型多角体病毒的分子生物学研究和流行病学研究;最后简介本文的研究目的和意义。
第二章:研究感染HycuNPV的美国白蛾幼虫的组织病理变化。电镜观察美国白蛾幼虫感染病毒后细胞组织内发生的一系列病理变化。感染48小时,细胞结构完整,细胞排列紧密。感染96小时,细胞核开始膨大,染色质凝结成块,形成病毒发生基质,在病毒发生基质周围有均一环状带(ringzone)。感染120~168小时期间,脂肪体细胞内多角体逐渐增多,部分细胞充满多角体。感染216小时,中肠组织解体,脂肪体部分细胞出现破裂,成熟的多角体溢出。感染240~262h,大部分细胞组织被解体,多角体充满体腔,幼虫濒于死亡。
第三章:对美国白蛾HycuNPV毒力进行生物活性测定。测定结果表明,感染美国白蛾2龄幼虫LC50=1.26~105 PIB/ml,3龄幼虫LC50=4.08x105 PIB/ml,4龄幼虫LC50=5.34x105 PIB/ml。以3×106 PIB/ml感染美国白蛾2龄幼虫LT50为7.625 d;3龄幼虫LT50为8.625 d:4龄幼虫LT50为9.875 d。以1×106 PIB/ml感染美国白蛾2龄幼虫LT50为9.625 d:3龄幼虫LT50为9.625 d;4龄幼虫LT50为10.625 d。
第四章:对HycuNPV基因组进行了限制性内切酶图谱分析,并对其两个特有基因orf121(hc121)、orf148(hc148)进行了克隆与原核表达。成功使用EcoR I、HindIII、Pst I和Xho I切开了HycuNPV基因组,并证实Kpn I和Xba I不能切开。利用已知序列设计不同引物将hc121基因、hc148基因分别扩增,连接到pET-28a载体上并在大肠杆菌中对其进行克隆和表达,经SDS-PAGE证明hc121基因在大肠杆菌中获得表达。此外,设计不带酶切位点的引物来PCR扩增克隆hc148基因,作为检测寄主是否感染HycuNPV的方法。