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阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种最为常见的与年龄高度相关且呈进行性改变的神经退行性疾病。其主要病理特征为大脑内老年斑形成和神经元纤维缠结。大量研究表明,β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)是诱发AD的核心环节。因此,围绕Aβ展开的对AD发生发展进程中的各种影响因素及其调节机制的探讨是当今研究的热点。花色苷(Anthocyanin)是植物性食物中广泛存在的一类糖苷衍生物。大量研究显示花色苷具有很强的抗氧化活性,并能发挥神经保护作用,但其机制并不清楚。表观遗传以及自噬调控机制参与AD发病过程中突触丢失、认知功能损伤。因此,本研究大胆提出,花色苷可能通过对表观遗传及自噬蛋白表达的调控,改善AD认知功能障碍。【目的】观察蓝莓提取物(Blueberry extracts,BB)围生期干预APP/PS1小鼠认知功能障碍的效用,以及矢车菊-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-β-glucoside,Cy-3G)对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞损伤的保护效应;重点探讨花色苷发挥神经保护作用的表观遗传与自噬调节机制。【方法】1.整体实验:清洁级成年APP/PS1小鼠28只(雌雄各半),同月龄野生型小鼠6只(雌雄各半),合笼后获得孕鼠。APP/PS1孕鼠随机分为阳性对照组(AD组)和蓝莓提取物干预组(AD+BB组);野生型孕鼠为阴性对照组(CT组)。CT组和AD组孕鼠自孕1天起,饲喂AIN-93饲料直至子鼠断乳(21d);而AD+BB组孕鼠自孕1天起,饲喂含2%蓝莓提取物的AIN-93饲料直至子鼠断乳(21d)。AD组和AD+BB组基因型鉴定为阳性的子鼠及CT组全部子鼠作为研究对象。干预结束后,待子代鼠9月龄时,Morris水迷宫实验(包括定向航行实验和空间探索实验)检测学习记忆能力;HE和4G8免疫组化染色观察脑组织的病理学改变;ELISA方法检测脑组织Aβ1-42的含量;南京建成试剂盒检测血清及脑组织MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性;TUNEL染色观察海马及皮层细胞凋亡情况;Western blot方法检测脑组织Caspase-3、LC3B、Beclin-1、Mecp2和Ac-H3(Lys9)蛋白的表达。2.体外实验:体外培养人源神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞;首先,进行Aβ25-35损伤浓度的筛选,设置对照组和不同浓度(5、10、15、20、25μmol/L)Aβ25-35处理组;其次,进行Cy-3G干预浓度的筛选,设置对照组、Aβ25-35处理组和不同浓度(10、25、50、100μmol/L)Cy-3G预孵育组;最后进行Cy-3G干预时间的筛选,设置对照组、Aβ25-35处理组和不同时间(3、6、12、24h)Cy-3G预孵育组。筛选结束后,设置对照组、Aβ25-35组、Aβ25-35+Cy-3G组和Cy-3G组,MTT法检测细胞活力;Hoechst染色法检测细胞凋亡率;荧光分光光度法检测细胞内ROS水平;Western blot方法检测细胞Mecp2、DNMT3a、Ac-H3(Lys9)、Ac-H4(Lys12)、LC3B和Beclin-1蛋白的表达。【结果】1.整体实验(1)蓝莓提取物干预对子代APP/PS1小鼠空间学习记忆能力的影响定向航行实验中,与CT组比较,AD组小鼠的潜伏时间明显延长(P<0.05);与AD组比较,AD+BB组小鼠的潜伏时间明显缩短(P<0.05)。空间探索实验中,与CT组比较,AD组小鼠穿越平台的次数明显减少(P<0.01);与AD组比较,AD+BB组小鼠穿越平台的次数明显增加(P<0.05)。(2)蓝莓提取物干预对子代APP/PS1小鼠脑组织病理学改变及Aβ1-42含量的影响HE染色结果显示AD组小鼠神经元萎缩,AD+BB组小鼠海马及皮层区组织结构及细胞形态较AD组均有明显改善,细胞排列整齐,分布均匀。免疫组化染色结果显示AD+BB组小鼠海马及皮层区老年斑数量均较AD组明显减少(P<0.05)。与CT组比较,AD组小鼠脑组织中Aβ1-42含量显著升高(P<0.01);而与AD组比较,AD+BB组小鼠脑组织中Aβ1-42含量明显降低(P<0.05)。(3)蓝莓提取物干预对子代APP/PS1小鼠抗氧化功能及神经元凋亡的影响与CT组比较,AD组小鼠血清和脑组织中MDA含量明显升高(P<0.05),而血清中SOD和GSH-Px活性均明显降低(P<0.05,P<0.01),脑组织中SOD活性也明显降低(P<0.05);与AD组比较,AD+BB组小鼠血清和脑组织中MDA含量明显降低(P<0.05,P<0.01),而血清中GSH-Px活性明显升高(P<0.05),脑组织中SOD活性也明显升高(P<0.01)。与CT组比较,AD组小鼠海马及皮层神经元凋亡率明显增加(P<0.05),而与AD组比较,AD+BB组小鼠海马及皮层神经元凋亡率显著降低(P<0.05)。与CT组比较,AD组小鼠脑组织Caspase-3表达显著增高(P<0.05),而与AD组比较,AD+BB组小鼠脑组织Caspase-3表达显著降低(P<0.01)。(4)蓝莓提取物干预对子代APP/PS1小鼠脑组织自噬及表观遗传相关蛋白表达的影响与CT组比较,AD组小鼠脑组织中LC3B-II/LC3B-I及Beclin-1蛋白表达均明显增高(P<0.05;P<0.01);而与AD组比较,AD+BB组小鼠LC3B-II/LC3B-I及Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05;P<0.01)。与CT组和AD+BB组比较,AD组小鼠脑组织Mecp2蛋白表达有降低趋势,Ac-H3K9蛋白表达有增高趋势,但差异均没有统计学意义。2.体外实验(1)Cy-3G对Aβ致SH-SY5Y细胞损伤、凋亡及ROS水平的影响Cy-3G对Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞保护作用的适宜浓度和适宜作用时间分别为100μmol/L和12h。与对照组比较,Aβ25-35处理可以使SH-SY5Y细胞活性显著降低(P<0.05),凋亡率显著增高(P<0.01),ROS的产生显著增加(P<0.01),而Cy-3G可以逆转上述变化。(2)Cy-3G对Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞内HDAC活性及表观遗传相关蛋白表达的影响与对照组比较,Aβ25-35组SH-SY5Y细胞内Mecp2蛋白表达有增高的趋势;与Aβ25-35组比较,Aβ25-35+Cy-3G组细胞内Mecp2蛋白表达有降低的趋势,但差异均无统计学意义。与对照组比较,Aβ25-35组SH-SY5Y细胞内DNMT3a蛋白表达明显增高(P<0.05);与Aβ25-35组比较,Aβ25-35+Cy-3G组细胞内DNMT3a蛋白表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,Aβ25-35组SH-SY5Y细胞内Ac-H3(Lys9)和Ac-H4(Lys12)蛋白表达均明显增高(P<0.01);与Aβ25-35组比较,Aβ25-35+Cy-3G组细胞内Ac-H3(Lys9)和Ac-H4(Lys12)蛋白表达均明显降低(P<0.01)。与对照组比较,Aβ25-35组SH-SY5Y细胞核内HDAC活性明显升高(P<0.01);与Aβ25-35组比较,Aβ25-35+Cy-3G组细胞核内HDAC活性明显下降(P<0.05)。(3)Cy-3G对Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞内自噬相关蛋白表达的影响与对照组比较,Aβ25-35组SH-SY5Y细胞内LC3B及Beclin-1蛋白表达均明显增高(P<0.05);与Aβ25-35组比较,Aβ25-35+Cy-3G组细胞LC3B及Beclin-1蛋白表达均显著降低(P<0.05)。【结论】1.蓝莓提取物围生期干预可以显著改善APP/PS1双转基因小鼠认知功能障碍。2.Cy-3G预孵育可以明显减缓Aβ25-35致SH-SY5Y细胞的损伤。3.花色苷可能通过抗凋亡、抗氧化和表观遗传-自噬调控机制在阿尔茨海默病动物和细胞模型中发挥神经保护作用。